一株利用煙草廢水紅酵母的篩選鑒定及發酵性能研究

席 宇， 吉彥龍， 李敏睿， 曹瑞麗， 王燕燕， 朱大恒

(鄭州大學 生物工程系 河南 鄭州 450001)

0 引言

煙梗是卷煙工業的廢棄物，約占煙葉總重20%～ 30%[1-2].煙梗中含有大量的糖類和氮類物質[3-4].目前廢棄煙梗多用來提取煙堿、果膠、煙酸，茄尼醇[5-6]或者用于堆肥[1].在煙草加工和煙草廢棄物處理過程中常產生大量的煙草廢水(TWW)，TWW中含有大量有機物質[7-10]，因此在TWW的處理前或處理過程中對其進行資源化利用是非常重要的.利用酵母菌將工農業廢棄物轉化為單細胞蛋白已引起科研工作者的極大興趣[11-15].紅酵母富含氨基酸、維生素及類胡蘿卜素等多種營養物質, 是天然色素源、極具潛力的飼料蛋白和食品添加劑, 具有很高應用價值[16-20].利用TWW發酵生產紅酵母尚未見報道.本文從廢棄煙梗的初期固態發酵物中篩選到一株紅酵母，在對其進行培養、形態和生理生化特征研究基礎上，初步鑒定為一株深紅酵母，探討了以其發酵TWW生產單細胞蛋白的潛力.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TWW來源于廢棄煙梗的固態發酵前的浸泡過程.廢棄煙梗由河南天昌煙草國際有限公司提供,直徑為0.15～ 0.50 cm, 長度為0.2～ 5.0 cm.β-類胡蘿卜素標品購自Fluka公司(>97.0%)，其余所有供試藥品和試劑均為分析純.

1.2 煙草廢水的預處理及成分分析

TWW于8 000 rpm離心5 min，上清液用于制備TWW培養基.TWW主要成分分析采用連續流動分析儀(AA3，德國)，pH值采用精密pH計(PHS-3C，上海精密儀器有限公司)進行測量.

1.3 培養基

富集培養采用酵母粉蛋白胨葡萄糖培養基(YPD)：1% 酵母粉(質量濃度)，2%蛋白胨(質量濃度)，2%葡萄糖(質量濃度).篩選和發酵采用TWW培養基，配方為預處理TWW，其中固體培養基瓊脂含量均為1.5%，菌種保藏和活化采用TWW斜面培養基.培養基滅菌條件為115 ℃滅菌20 min.

1.4 菌株分離鑒定及發酵培養

1.4.1菌株篩選

從廢棄煙梗初期固態發酵物[1]中取樣5 g接種于裝有50 mL 無菌生理鹽水和玻璃珠的250 mL 三角瓶中, 振蕩30 min后靜置片刻,取5 mL 懸浮液接種于30 mL含0.25%丙酸鈉的YPD培養液, 28 ℃和180 rpm富集培養48 h，取0.2 mL富集培養液涂布于TWW篩選平板上, 28 ℃培養3 d,定期觀察.挑選紅色、粉紅色、橙紅色且生長迅速的菌落進行分離純化.根據形態特征初步確定為酵母菌后接種于TWW斜面培養基, 4 ℃保存備用.本實驗的液體培養條件均為28 ℃和180 rpm.

1.4.2分離菌株的鑒定

分離酵母菌的鑒定采用形態觀察和生理生化特征分析相結合的方法進行.

1.4.3菌株的發酵培養

挑取一環斜面保藏的培養物，接種于30 mL的TWW液體培養基中，培養24 h，以體積濃度5%的接種量加入到50 mL的TWW培養液中同條件培養4 d，培養物進行細胞產量和色素含量分析.

分別在TWW中加入質量濃度0.8%蔗糖、酵母粉、蛋白胨、NaH2PO4、NH4Cl和(NH4)2SO4來考察6種因子的添加對菌株JLC細胞產量和色素含量的影響，接種方法和培養條件同上.

1.5 測定方法

1.5.1生物量測定

取30 mL發酵液，4 000 rpm離心10 min，收集菌體，自來水洗滌2次，60 ℃烘至恒重后稱重.

1.5.2類胡蘿卜素的提取與測定

類胡蘿卜素的提取按文獻[21]方法進行，干菌體經鹽酸-熱處理破壁后，以丙酮抽提類胡蘿卜素.用紫外可見分光光度計在350～ 600 nm 波長掃描類胡蘿卜素丙酮浸提液，找出最高吸收波長.將提取液適當稀釋后,測定最高吸收波長處吸光度, 計算類胡蘿卜素含量

式中,Aλmax為色素最大吸收波長處的吸光度,D為測定試樣的稀釋倍數,V為提取色素所用溶劑量(mL)，W為菌體重量(g), 0.16為類胡蘿卜素的消光系數.

類胡蘿卜素產量的計算：類胡蘿卜素產量(mg/L)=色素含量×細胞產量.

2 結果與討論

2.1 煙草廢水主要特征

TWW中含有大量有機物質，主要包括可溶性多糖、煙堿、酚類和氮等，其主要特征如表1.TWW的pH值為5.3～5.6，因此TWW的營養和理化條件符合酵母菌對營養和培養條件的要求.

表1 TWW主要成分分析Tab.1 The major characteristics analysis of TWW

2.2 篩選菌株的鑒定

2.2.1培養和形態特征

經過富集培養和劃線分離，從TWW平板中篩選出一株生長良好的酵母菌，命名為JLC.JLC在YPD培養基上菌落較大，表面光滑、隆起、粘稠濕潤、不透明，橙紅色，邊緣整齊(圖1a).顯微鏡檢表明細胞多為球形或橢圓形，出芽生殖(如圖1b).

2.2.2生理生化特征

菌株JLC的主要生理生化特征見表2.菌株JLC能夠同化碳源海藻糖、麥芽糖、阿拉伯糖、蔗糖、半乳糖、棉籽糖和木糖；不能同化碳源密二糖、D-氨基葡萄糖、2-酮基-葡萄糖酸鹽、赤蘚醇、纖維二糖、鼠李糖、乳酸、肌醇、甘露醇，山梨醇和甘油等；不能夠利用硝酸鹽，不耐受放線菌酮.結合形態、培養和生理生化特征，參考文獻初步鑒定JLC為一株深紅酵母(Rhodotorularubra).

圖1 菌株JLC的菌落和菌體特征Fig.1 The colony and microscopic characters of JLC in YPD medium

生理生化反應結果生理生化反應結果2-酮基-葡萄糖酸鹽-半乳糖+乳酸-纖維二糖-密二糖-棉籽糖+肌醇-山梨醇-海藻糖+松三糖-麥芽糖+鼠李糖-D-氨基葡萄糖-D-葡萄糖苷-赤蘚醇-甘油-阿拉伯糖+木糖+甘露醇-硝酸鹽-蔗糖+放線菌酮耐受試驗-

注：+ 表示生長；- 表示不生長

2.3 不同添加物對篩選菌株的生物量的影響

TWW中含有尼古丁，對微生物的生長具有抑制作用[9]，但菌株JLC在TWW中生長迅速，不同的添加物對JLC的生物量有顯著影響，從圖2可看出，在TWW培養液中，細胞干重可達9.37 g/L.蔗糖、蛋白胨、酵母粉和NaH2PO4的添加能夠提高生物量，當添加NaH2PO4時，細胞干重可達到14.87 g/L；添加NH4Cl和(NH4)2SO4生物量稍微下降.這可能由于TWW不缺乏氮源或者無機氮源不適合酵母菌生長造成的.

2.4 篩選菌株的色素特征及測定

菌株JLC色素的丙酮抽提液與β-胡蘿卜素標準品的光吸收掃描圖譜相比, 其最大吸收峰有偏離(圖3).β-類胡蘿卜素標品最大吸收波長在450 nm, 菌株JLC的色素最高吸收波長在485 nm，具有類胡蘿卜素的典型雙肩峰特征，這與報道深紅酵母的類胡蘿卜素最大吸收波長相一致[20].

圖2 不同添加物對JLC細胞產量的影響Fig.2 Effect of different additives on cell biomass of JLC

圖3 β-類胡蘿卜素和菌株JLC色素的掃描光譜比較Fig.3 UV-visible spectra of β-carotenoids and pigments extracted from strain JLC

對JLC色素含量和產量進行考察，結果如表3，在TWW中色素含量為200.52 μg/g，不同添加物對細胞色素含量有不同影響.除NaH2PO4外，其他添加物都導致細胞中色素含量降低.雖然色素含量略低，由于生物量提高，添加蔗糖、酵母粉、蛋白胨和NaH2PO4的TWW中色素產量均提高，最大為3.04 mg/L，類胡蘿卜素產量相對較高[17-18].類胡蘿卜素的合成與菌體的生長周期有關，營養物添加可能影響細胞的生長周期和色素的形成時間，培養時間的增加能提高色素的含量和產量.為獲得大量的菌體或色素，發酵培養中需要進一步延長培養時間，優化培養條件.

3 結論

通過對菌株JLC的初步研究，可得出如下結論：

(1)從煙草廢棄物中分離出一株酵母菌JLC，鑒定為深紅酵母，菌株JLC可在TWW中生長，5%的接種量28 ℃培養4 d, 細胞干重可達9.37 g/L；

(2)向TWW中添加營養物質可提高菌株JLC的生物量，其中添加0.8%的NaH2PO4可顯著提高生物量，5%的接種量，28 ℃培養4 d,細胞干重可達14.87 g/L；

(3)菌株JLC富含類胡蘿卜素，其色素最高吸收峰在485 nm，初步實驗最大色素含量為204.77 μg/g,最大色素產量為3.04 mg/L.

表3 不同添加物對菌株JLC色素含量和產量的影響Tab.3 Effect of different additives on carotenoid content and yield of strain JLC

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