地黃不同種質資源產量和指標成分HPLC測定比較

李建軍， 王 瑩， 周延清， 李明軍， 李景原

(河南師范大學 生命科學學院 河南省高校道地中藥材保育及利用工程技術研究中心 河南 新鄉 453007)

0 引言

地黃(RehmanniagtutinosaLibose)為玄參科多年生草本植物，是常用的補益中藥，始載于《神農本草經》，列為上品.主產于河南、河北、山東、山西、內蒙古及東北，現全國大部分地區有栽培.河南懷慶府是地黃的道地產區，以溫縣、博愛、武陟、孟縣等地產量最大.地黃具有滋陰清熱、補血止血等功效，臨床應用極為廣泛.由于采收及炮制加工方法及藥效的差異，地黃藥材分為鮮地、生地和熟地.國內外對其化學成分、藥理作用的研究已有較多的報道[1].

迄今為止，對于地黃的質量控制標準，尚無很完善的方法.一直以來常用梓醇作為地黃尤其是鮮地和生地的指標成分進行品質評價.2010年版《中國藥典》把梓醇和毛蕊花糖苷都列為地黃指標成分，梓醇作為地黃的主要有效成分之一，具有降血糖、利尿和緩瀉等作用[2-4]；毛蕊花糖苷作為地黃的主要有效成分之一，對神經系統、免疫系統具有明顯的作用，特別是針對老年癡呆、慢性腎炎等疾病具有明顯的治療作用[5-7].根據藥典規定并參考相關文獻，作者研究了梓醇和毛蕊花糖苷的HPLC測定方法，進行了方法學考察，取得了比較滿意的結果，并對9種主要地黃種質資源進行了梓醇和毛蕊花糖苷含量的分析比較,為良種繁育推廣和新品種選育提供相關數據支撐[8-9].

1 材料和方法

1.1 材料

2010年11月采自封丘地黃資源圃中，9個主要種質資源經河南師范大學李發啟副教授鑒定,采用同樣的烘干粉碎方法獲得樣品.

1.2 儀器與試劑

Agilent 1200系列高效液相色譜儀，G1311A四元泵，自動控溫自動進樣器，G1316A柱溫箱，XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，FA2004N型電子天平、JH502型電子天平(上海精密科學有限公司)，Thermo自動雙重純水蒸餾器.乙腈、甲醇為色譜純，其他為分析純，水為二次蒸餾水；梓醇標樣(蘋壹生物)，毛蕊花糖苷標樣(四川維克奇生物科技有限公司).

2 實驗方法

2．1 梓醇

2.1.1色譜條件 以乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)為流動相；檢測波長為210 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL.

2.1.2對照品溶液的制備 精密稱取梓醇對照品4.65 mg，置5 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻.

2.1.3供試品溶液的制備 精密稱定烘干粉碎后的地黃粉0.8 g，置錐形瓶中，加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液10 mL，濃縮至近干，殘渣用流動相溶解，轉移至10 mL量瓶中，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得.

2.1.4測定法 對照品與供試品溶液各進樣10 μL進行液相色譜分析.按外標峰面積法計算梓醇的含量.

2.3.3 監護時間 患者在ICU滯留時間越長，與外界隔離時間越長，ICU環境及各種社會心理因素對患者的刺激就越大，患者由此而產生的不良情緒也越多，其發生ICU綜合征的概率也就越大。熊澗秋等［21］對430例體外循環術后ICU患者分析表明，滯留時間≥5 d的289例患者中有76例(26.3%)發生ICU綜合征，滯留時間＜5 d的141例患者中有17例(12.06%)發生ICU綜合征。提示患者滯留時間越長，其ICU綜合征發生率越高。

2.1.5線性關系 精密吸取上述對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置2 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻.將各個濃度的對照品溶液進樣10 μL進行液相色譜分析.以梓醇對照品質量濃度為橫坐標，梓醇峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程為：Y=2 296.3X-19.817，r=0.999 9，梓醇在0.465～4.65 μL線性關系良好.

2.1.6精密度試驗 取同一對照品溶液，按含量測定方法及色譜條件進行測定，重復5次測定梓醇峰面積，RSD為0.19%.表明儀器精密度良好.

2.1.7穩定性試驗 取對照品溶液及供試品溶液，于室溫分別放置0、2、4、8、10 h，按上述色譜條件進樣10 μL，測定梓醇峰面積，對照品及供試品的RSD分別為0.83%和0.76%.結果表明對照品及供試品溶液在10 h內穩定.

2.1.8重復性試驗 精密稱取同一批地黃樣品3份，按含量測定方法進行測定，樣品的梓醇平均含量為1.47%，RSD為3.82%.表明本實驗方法重復性良好.

2.1.9數據處理 試驗數據采用Excel和SPSS統計分析軟件進行計算和分析，以平均值±標準差來表示結果.

2.2 毛蕊花糖苷(麥角甾苷)

2.2.1色譜條件 以乙腈-0.1%醋酸溶液(16∶84)為流動相；檢測波長為334 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL.

2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花糖苷對照品8 mg，置50 mL 量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液.

2.2.3供試品溶液的制備 精密稱定烘干粉碎后的地黃粉0.8 g，置錐形瓶中，加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液20 mL，濃縮至近干，殘渣用流動相溶解，轉移至5 mL量瓶中，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得.

2.2.4測定法 對照品與供試品溶液各進樣10 μL進行液相色譜分析.按外標峰面積法計算毛蕊花糖苷的含量.

2.2.6精密度試驗 取同一對照品溶液，按含量測定方法及色譜條件進行測定，重復5次測定毛蕊花糖苷的峰面積，RSD為0.97%.表明儀器精密度良好.

2.2.7穩定性試驗 取對照品溶液及供試品溶液，于室溫分別放置0、2、4、8、10 h，按上述色譜條件進樣10 μL，測定毛蕊花糖苷峰面積，對照品及供試品的RSD分別為0.047%和0.23%.結果表明對照品及供試品溶液在10 h內穩定.

2.2.8重復性試驗 精密稱取同一批地黃樣品3份，按含量測定方法進行測定，樣品的毛蕊花糖苷平均含量為3.95%，RSD為0.62%，表明本實驗方法重復性良好.

2.2.9數據處理 試驗數據采用Excel和SPSS統計分析軟件進行計算和分析，以平均值±標準差來表示結果.

3 結果與分析

3.1 同一產地不同地黃種質資源產量的比較

在同一產地，分別隨機選取5個點，每個點按行連續取10株，測每個品種的單株鮮重，見圖1.

圖1 不同品種地黃產量比較Fig.1 Comparative studies on the strains of cultivars of Rehmannia

由圖1可知,9個品種(系)單株產量中，沁懷單株產量最高，且沁懷>北京3號>生津>懷地3號>脫毒苗85-5>85-5>懷地1號>北京1號>懷地2號.經SPSS分析，沁懷與北京3號差異不顯著，與其他品種差異極顯著，脫毒苗85-5和85-5在產量上差異不顯著.

3.2 同一產地不同地黃種質資源樣品中梓醇含量測定結果

以同樣的色譜條件分析梓醇標準品和樣品，得到各樣品的梓醇含量見表1，高效液相色譜圖如圖2所示.

表1 樣品中梓醇含量測定結果Tab.1 Results of catalpol content in the samples

由表1可知：9個地黃樣品梓醇含量差異明顯，其中沁懷最高為3.70%，懷地1號最低為2.23%，均高于2010年藥典規定，且沁懷3.70%(對照)>懷地3號3.68%(P>0.05)>85-5 3.05%(P<0.01)>生津2.91%(P<0.01)>北京3號 2.55%(P<0.01)>懷地2號 2.31% (P<0.01)>脫毒苗85-5 2.30%(P<0.01)>北京1號 2.25%(P<0.01)>懷地1號 2.23%(P<0.01);脫毒苗85-5樣品梓醇含量低于非脫毒苗85-5的梓醇含量，且差異極顯著，有關機理有待進一步研究.由圖2各樣品的色譜圖的峰面積大小，也可以直觀地反映出樣品之間的差異.

3.3 同一產地不同地黃種質資源樣品中毛蕊花糖苷含量測定結果

以同樣的色譜條件分析毛蕊花糖苷標準品和樣品，得到各樣品的毛蕊花糖苷的含量見表2，高效液相色譜圖如圖3所示.

由表2可知，9個地黃品種樣品毛蕊花糖苷的含量差異明顯，其中85-5最高為0.13%，北京3號最低為0.03%，毛蕊花糖苷含量均都高于2010年藥典規定，且85-5 0.13%(對照)>北京1號 0.12%(P>0.05)>懷地2號 0.10%(P<0.01)=生津0.10%(P<0.01)>懷地3號0.08%(P<0.01)>懷地1號0.06%(P<0.01)>沁懷 0.04%(P<0.01)=脫毒苗85-5 0.04%(P<0.01)>北京3號0.03%(P<0.01)；脫毒苗85-5毛蕊花糖苷含量小于85-5，且差異極顯著，有關機理有待進一步研究．由圖3各樣品的色譜圖峰面積的大小，可直觀看出樣品之間的差異.

圖2 梓醇的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of catalpol

編號品種毛蕊花糖苷平均含量/%185-50.13±0.028aA2北京1號0.12±0.004abAB3北京3號0.03±0.001eF4生津0.10±0.004cBC5沁懷0.04±0.008deEF6懷地1號0.06±0.001dDE7懷地2號0.10±0.003bcBC8懷地3號0.08±0.007cCD9脫毒苗85-50.04±0.014deEF

圖3 毛蕊花糖苷的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of verbascoside

4 討論

根據大量文獻報道，地黃指標成分含量差異較大，究其原因是地黃的品種及其生長環境、栽培措施、采樣收集時間及加工炮制方法不同等綜合因素造成的.本實驗將不同種質資源栽種在同一塊試驗田中統一管理，并參照2010版《中國藥典》方法及相關文獻，采用高效液相色譜法測其成分，以盡量保證各品種的客觀條件基本平行，使測定結果更客觀、更真實地反映不同種質資源之間成分含量和產量的差異.

通過對地黃同一產地9個品種(系)的產量試驗結果得出：沁懷>北京3號>生津>懷地3號>脫毒苗85-5>85-5>懷地1號>北京1號>懷地2號，從產量方面說明沁懷、北京3號、生津、懷地3號、脫毒苗85-5和85-5的產量比較高，可以在生產中推廣.

2010年版《中國藥典》將梓醇和毛蕊花糖苷納入地黃主要指標性成分，并規定地黃中梓醇含量不得少于0.20%，毛蕊花糖苷含量不得少于0.020%.實驗結果9個地黃資源樣品梓醇含量范圍在2.23%～3.70%，毛蕊花糖苷含量范圍在0.03%～0.13%.兩種指標性成分都遠高于藥典規定的最低含量，說明懷地黃資源品質比較好.

通過實驗數據分析可知，地黃不同種質資源樣品間指標成分含量差異明顯.其中梓醇含量：沁懷最高為3.70%(對照)>懷地3號3.68%(P>0.05)>85-5 3.05%(P<0.01)>生津 2.91%(P<0.01)>北京3號 2.55%(P<0.01)>懷地2號 2.31% (P<0.01)>脫毒苗85-5 2.30%(P<0.01)>北京1號 2.25%(P<0.01)>懷地1號 2.23%(P<0.01),毛蕊花糖苷含量：85-5 0.13%(對照)>北京1號 0.12%(P>0.05)>懷地2號 0.10%(P<0.01)=生津0.10%(P<0.01)>懷地3號0.08%(P<0.01)>懷地1號0.06%(P<0.01)>沁懷 0.04%(P<0.01)=脫毒苗85-5 0.04%(P<0.01)>北京3號0.03%(P<0.01).

綜合實驗結果分析可知，地黃產量與其指標成分含量之間沒有相關性，地黃不同種質資源樣品中2個指標成分含量之間沒有相關性；85-5、生津、沁懷、懷地3號和北京1號都可以作為品質育種的親本材料；指標成分脫毒85-5明顯低于85-5且差異極顯著，究竟是什么原因造成其次生代謝產物差異的，機理有待進一步研究.

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