靜態(tài)注射化學(xué)發(fā)光法測定對乙酰氨基酚及其發(fā)光機(jī)理研究

張慧麗, 于 斐, 吳擁軍, 玉崧成, 張洪權(quán)

(1.鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 河南 鄭州 450001； 2.鄭州大學(xué) 化學(xué)系 河南 鄭州 450001)

0 引言

對乙酰氨基酚，商品名撲熱息痛，為芳環(huán)對位取代的苯胺類藥物，有解熱鎮(zhèn)痛作用.建立快速、靈敏、簡便、準(zhǔn)確的對乙酰氨基酚含量分析方法在臨床醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)研究以及藥物質(zhì)量控制方面有重要意義.目前，測定對乙酰氨基酚多用紫外分光光度法[1]、高效液相色譜法[2]、熒光法[3]以及化學(xué)發(fā)光法[4-5]等.Luminol-H2O2-HRP作為化學(xué)發(fā)光最經(jīng)典的體系，具有發(fā)光迅速、靈敏度高等特點, 已經(jīng)用于一些藥物的測定[6].但該體系發(fā)光強(qiáng)度較小，發(fā)光延遲時間較短，其應(yīng)用受到一定的限制.但加入一些酚類物質(zhì)時，體系的發(fā)光信號不同程度地增強(qiáng)，背景值不同程度地被抑制，且發(fā)光時間有所延長.

有關(guān)對乙酰氨基酚的化學(xué)發(fā)光分析多為基于魯米諾-鐵氰化鉀發(fā)光體系，采用流動注射化學(xué)發(fā)光技術(shù)實現(xiàn)對乙酰氨基酚的測定[7-9].利用靜態(tài)注射化學(xué)發(fā)光技術(shù)測定對乙酰氨基酚的研究尚未見報道.基于對乙酰氨基酚對luminol-H2O2-HRP體系的增強(qiáng)作用與其濃度呈線性關(guān)系，作者建立了靜態(tài)注射化學(xué)發(fā)光法，快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測了對乙酰氨基酚的含量，并對可能的發(fā)光機(jī)理進(jìn)行了探討.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SIRIUS單管式化學(xué)發(fā)光檢測儀(German Berthold)；UV1601紫外可見分光光度計(Japan Shimadzu)；F-4500熒光光度計(Japan Hitachi).魯米諾(J&K Chemical LTD.)、過氧化氫(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、辣根過氧化物酶(ROCH Inc.)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；對乙酰氨基酚(河南天方藥業(yè)股份有限公司)、對乙酰氨基酚片(吉林省紅石藥業(yè)有限公司)；其他試劑均為分析純；實驗用水均為MillQ純水.

1.2 樣品的處理

準(zhǔn)確稱量20片對乙酰氨基酚片劑 (標(biāo)示量:0.30 g/片)，研細(xì)、熱水溶解、過濾，取濾液稀釋定容(每毫升相當(dāng)于30 mg對乙酰氨基酚)，搖勻備用.

1.3 實驗方法

SIRIUS單管式化學(xué)發(fā)光檢測儀參數(shù)設(shè)置為：一泵和二泵每次分別吸取100 μL的H2O2和luminol+對乙酰氨基酚，一泵延遲時間為0.1 s，二泵延遲時間為0.2 s，檢測延遲時間為0.1 s.準(zhǔn)確移取一定體積的HRP溶液于加樣管中，在選定的實驗條件下， 記錄發(fā)光強(qiáng)度.以發(fā)光增強(qiáng)值的對數(shù)與樣品濃度的關(guān)系進(jìn)行定量分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 對乙酰氨基酚的增強(qiáng)效果

以相同濃度的反應(yīng)介質(zhì)(luminol-H2O2-HRP)及相同pH值的緩沖體系(pH=8.5 Tris-HCl)，比較加入對乙酰氨基酚前后體系的相對光單位，結(jié)果如圖1.

對乙酰氨基酚：4.0×10-4 mol·L-1； 過氧化氫：1.2×10-2 mol·L-1；魯米諾： 7.0×10-4 mol·L-1； 辣根過氧化物酶：5.0×10-6 mg·mL-1；緩沖體系pH值：8.5圖1 對乙酰氨基酚對luminol-H2O2-HRP 體系發(fā)光增強(qiáng)效果圖Fig.1 Enhancement effect of acetaminophen on chemilu-minescence intensity of luminol-H2O2-HRP system

由圖1可以看出，對乙酰氨基酚能明顯增強(qiáng)luminol-H2O2-HRP體系的發(fā)光強(qiáng)度，與空白相比增強(qiáng)30倍，并且發(fā)光延遲時間較長，發(fā)光值較穩(wěn)定.

2.2 發(fā)光體系的優(yōu)化

2.2.1對乙酰氨基酚濃度的選擇 考察了1.0×10-4～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)不同濃度對乙酰氨基酚對發(fā)光強(qiáng)度的影響.結(jié)果顯示(見圖2)，在1.0×10-4～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)，隨對乙酰氨基酚濃度的增大發(fā)光強(qiáng)度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢.當(dāng)濃度增加到4.0×10-4mol/L時，發(fā)光值達(dá)到最大.所以，初步選擇濃度為4.0×10-4mol/L的對乙酰氨基酚來優(yōu)化其他發(fā)光底物的濃度.

2.2.2luminol濃度的選擇 考察了1.5×10-4～2.0×10-3mol/L范圍內(nèi)不同濃度的魯米諾對發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖3所示.從圖3可以看出，隨著魯米諾濃度的增加，體系發(fā)光強(qiáng)度逐漸增加.當(dāng)魯米諾的濃度大于1.3×10-3mol/L時增加速度趨于緩慢.同時分別改變H2O2、HRP的濃度，相對發(fā)光強(qiáng)度隨魯米諾濃度變化的趨勢同圖3(圖略).故選擇此濃度用于后續(xù)試驗.

過氧化氫：1.2×10-2mol·L-1；魯米諾：7.0×10-4mol·L-1；辣根過氧化物酶：5.0×10-6mg·mL-1；緩沖體系pH值：8.5

圖2對乙酰氨基酚濃度的影響
Fig.2Effect of acetaminophen concentration on chemiluminescence intensity

對乙酰氨基酚：4.0×10-4mol·L-1；過氧化氫：1.2×10-2mol·L-1；辣根過氧化物酶：5.0×10-6mg·mL-1； 緩沖體系pH值：8.5

圖3luminol濃度的影響
Fig.3Effect of luminol concentration on chemiluminescence intensity

2.2.3過氧化氫濃度的選擇 考察了1.5×10-3～3.0×10-2mol/L范圍內(nèi)不同濃度的過氧化氫對發(fā)光強(qiáng)度的影響.結(jié)果顯示(見圖4)，在1.5×10-3～6.0×10-3mol/L范圍內(nèi)，發(fā)光值隨過氧化氫濃度的增大而增大，而后逐漸下降.所以，過氧化氫濃度選擇為6.0×10-3mol/L.

2.2.4體系的pH值選擇 考察了不同pH值的Tris-HCl緩沖溶液對發(fā)光值的影響.結(jié)果顯示(見圖5)，當(dāng)pH為8.5時，相對發(fā)光強(qiáng)度最大.

對乙酰氨基酚：4.0×10-4mol·L-1;魯米諾：1.3×10-3mol·L-1；辣根過氧化物酶：5.0×10-6mg·mL-1；緩沖體系pH值：8.5

圖4過氧化氫濃度的影響
Fig.4Effect of hydrogen dioxide concentration on chemiluminescence intensity

對乙酰氨基酚：4.0×10-4 mol·L-1；過氧化氫：6.0×10-3 mol·L-1；魯米諾：1.3×10-3 mol·L-1；辣根過氧化物酶：5.0×10-6 mg·mL-1

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在所選擇的最佳條件下，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)值的對數(shù)與對乙酰氨基酚濃度在4.0×10-4～7.5×10-3mol/L 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系.為了提高測定的精密度，對標(biāo)準(zhǔn)曲線分段繪制.濃度在4.0×10-4～6.0×10-4mol/L范圍內(nèi)回歸方程為：lg(B-B0)=-0.020 4c+7.256 9 (R2=0.996 1，n=3) ；濃度在1.0×10-3～7.5×10-3mol/L范圍內(nèi)回歸方程為：lg(B-B0)=-0.158 2c+7.176 8 (R2=0.992 2,n=3)(B為加入對乙酰氨基酚的相對發(fā)光值；B0為空白相對發(fā)光值).

2.4 精密度及檢測限

對3.2×10-3mol/L的對乙酰氨基酚溶液平行測定10次，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.68%.根據(jù)IUPAC規(guī)定，計算出對乙酰氨基酚的檢測限為1.6×10-4mol/L.

2.5 回收率

在空白樣品基質(zhì)中分別加入4.0×10-4mol/L、2.0×10-3mol/L、5.0×10-3mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，相同實驗條件下每個濃度平行測定3次求平均回收率，結(jié)果如表1所示.

表1 回收率的測定(n=3)Tab.1 Results of recoveries

2.6 樣品的測定

按照實驗部分所描述的方法，對對乙酰氨基酚片劑中的對乙酰氨基酚含量平行測定3次，根據(jù)發(fā)光增強(qiáng)值及標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品含量.結(jié)果如表2，用本法測得的結(jié)果與用藥典方法中紫外可見分光光度法[10]所得的結(jié)果相差不大.表明作者所建立的方法測定對乙酰氨基酚的含量準(zhǔn)確可靠，簡單可行.

表2 化學(xué)發(fā)光法和紫外分光光度法測定結(jié)果 (n=3)Tab.2 Results of acetaminophen tablets by chemiluminescence and UV spectroscopy

3 機(jī)理探討

在魯米諾化學(xué)發(fā)光體系中，文獻(xiàn)[11]報道，發(fā)光體為激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸根離子(3-AP).實驗中，使用改裝后的F-4500熒光分光光度計，選用化學(xué)發(fā)光功能項，掃描了luminol+H2O2+HRP和luminol+H2O2+HRP+對乙酰氨基酚發(fā)光體系，發(fā)現(xiàn)兩者的最大峰均為425 nm，這與文獻(xiàn)報道的3-AP的最大峰一致，說明本體系的發(fā)光體仍為激發(fā)態(tài)的3-AP.對乙酰氨基酚的加入只是改變了體系中激發(fā)態(tài)的3-AP的產(chǎn)生速率.

為了明確對乙酰氨基酚在本體系中所起的作用，用紫外分光光度計掃描了不同溶液混合后的吸收光譜，如圖6所示.由曲線a可以觀察到，在pH=8.5的緩沖溶液中魯米諾的紫外-可見吸收光譜有三個吸收峰，第一吸收峰可認(rèn)為是分子內(nèi)π-π*躍遷， 它需要的能量較低，吸收峰一般處于紫外光區(qū)，其特征摩爾吸光系數(shù)較大，一般大于104，為強(qiáng)吸收帶.當(dāng)luminol與H2O2、HRP作用生成3-氨基鄰苯二甲酸根離子時，π鍵活動性增加，使基態(tài)π與激發(fā)態(tài)π*間的能量差減小，所以共軛π電子躍遷吸收帶向長波方向移動，同時摩爾吸光系數(shù)增大；而第二、第三吸收峰為分子內(nèi)相應(yīng)基團(tuán)n-π*的躍遷，因為這些基團(tuán)不涉及π鍵的積累與否，所以無紅移、藍(lán)移現(xiàn)象產(chǎn)生，只有隨著濃度的降低，吸收峰下降的變化趨勢，比較圖6中的曲線a、b、c，正好與此一致.

加入對乙酰氨基酚后，測得其混合溶液的紫外-可見吸收光譜，見曲線d，與之相比較作出e和f的理論疊加曲線g，g、d兩曲線相比較可以明顯看到，加入對乙酰氨基酚后魯米諾的紫外-可見吸收特性表現(xiàn)出并非簡單疊加，特別是第一吸收峰有明顯的提高，可能的原因是對乙酰氨基酚上存在的具有吸電子效應(yīng)的乙酰基，并且取代基為雜氮原子，所對應(yīng)的苯氧自由基由于π-離域效應(yīng)而更穩(wěn)定，可作為HRP的第二底物(即供AH)，顯著加快酶的循環(huán)速度，導(dǎo)致魯米諾游離基的濃度增大，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增加[12]，同時由于π鍵的積累吸收峰發(fā)生一定的紅移現(xiàn)象.

a：1.3×10-3mol·L-1魯米諾；b：1.3×10-3mol·L-1魯米諾+6.0×10-3mol·L-1過氧化氫；c：1.3×10-3mol·L-1魯米諾+6.0×10-3mol·L-1過氧化氫+5.0×10-6mg·mL-1辣根過氧化酶

d：1.3×10-3mol·L-1魯米諾+6.0×10-3mol·L-1過氧化氫+5.0×10-6mg·mL-1辣根過氧化酶+4.0×10-4mol·L-1對乙酰氨基酚；e：1.3×10-3mol·L-1魯米諾+6.0×10-3mol·L-1過氧化氫+5.0×10-6mg·mL-1辣根過氧化酶；f：4.0×10-4mol·L-1對乙酰氨基酚;g:e和f的理論疊加曲線

圖6不同溶液混合后的吸收光譜
Fig.6Absorption spectra of different mixing solutions

4 結(jié)論

1)對乙酰氨基酚增強(qiáng)發(fā)光效果顯著，是化學(xué)發(fā)光luminol-HRP-H2O2體系中一種較為經(jīng)濟(jì)的增強(qiáng)劑，且實驗用水作為溶劑，與其他用N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜作為溶劑的酚類增強(qiáng)劑相比，對環(huán)境污染小，是一種很有前途的綠色發(fā)光增強(qiáng)劑.

2)利用對乙酰氨基酚的增強(qiáng)效果與其濃度的關(guān)系，建立了測定解熱鎮(zhèn)痛的非處方藥品中對乙酰氨基酚含量的測定方法.該方法簡單、快速并且精密度、準(zhǔn)確度都較為滿意，受藥品輔料的干擾較小，是一種很有前景的測定方法.

3)在研究中發(fā)現(xiàn)，對乙酰氨基酚的加入改變了luminol-H2O2-HRP體系中激發(fā)態(tài)的產(chǎn)生速率從而使發(fā)光信號增強(qiáng).

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