螺內(nèi)酯對急性心肌梗死心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2mRNA及BaxmRNA表達(dá)影響

許香梅，任曉敏，劉曙光，劉海云，王曉燕，董士民

（1.河北省石家莊市第一醫(yī)院心內(nèi)科，河北石家莊，050011；2.河北省石家莊市供水醫(yī)院內(nèi)科，河北石家莊，050021；3.河北省石家莊市橋東區(qū)休門衛(wèi)生院內(nèi)科，河北石家莊，050011；4.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院急診科，河北石家莊，050051）

螺內(nèi)酯對急性心肌梗死心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2mRNA及BaxmRNA表達(dá)影響

許香梅1，任曉敏1，劉曙光2，劉海云3，王曉燕1，董士民4

（1.河北省石家莊市第一醫(yī)院心內(nèi)科，河北石家莊，050011；2.河北省石家莊市供水醫(yī)院內(nèi)科，河北石家莊，050021；3.河北省石家莊市橋東區(qū)休門衛(wèi)生院內(nèi)科，河北石家莊，050011；4.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院急診科，河北石家莊，050051）

目的研究醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯對心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bc1-2mRNA及BaxmRNA表達(dá)的作用。方法結(jié)扎左冠狀動脈前降支制造大鼠左心室大面積心肌梗死模型。術(shù)后存活大鼠共72只，隨機(jī)分為心肌梗死（acute myocardia1 infarction，AMI）對照組（AMI組）、螺內(nèi)酯（spirono1actone，Spi）治療組（Spi組）及假手術(shù)組（Sham組），每組24只。分別于術(shù)后48h，7、14、21d用PCR方法測定非梗死區(qū)心肌細(xì)胞Bc1-2mRNA和BaxmRNA的表達(dá)。結(jié)果與Sham組相比較，AMI組和Spi組大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞Bc1-2表達(dá)在48h，7、14、21d顯著降低（P＜0.01），BaxmRNA表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）；與AMI組比較，Spi組大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞Bc1-2和BaxmRNA基因表達(dá)在48h、7d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），14、21d時心肌細(xì)胞BCL-2基因表達(dá)均升高（P＜0.05和P＜0.01），BaxmRNA基因表達(dá)均顯著降低（P＜0.05和P＜0.01）。結(jié)論螺內(nèi)酯可增加急性心肌梗死后大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bc1-2mRNA的表達(dá)和減弱BaxmRNA的表達(dá)。

心肌梗死；細(xì)胞凋亡；螺內(nèi)酯

細(xì)胞凋亡是一種受多種基因調(diào)控的細(xì)胞自身程序性死亡［1］。研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡是引起急性心肌梗死后心室重構(gòu)的重要因素。長期大劑量使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑治療產(chǎn)生所謂的“醛固酮逃逸現(xiàn)象”。因而醛固酮受體拮抗劑在心室重構(gòu)中具有不可替代的作用。醛固酮受體拮抗劑可使心肌纖維化程度減輕，心肌順應(yīng)性改善，心室肥厚逆轉(zhuǎn)。鑒于醛固酮對心室重構(gòu)的影響，本課題通過急性心肌梗死（acute myocardia1 infarction，AMI）大鼠模型，探討醛固酮受體拮抗劑影響AMI后心室重構(gòu)的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 大鼠AMI模型制作：結(jié)扎左冠狀動脈前降支制造大鼠左心室大面積AMI模型。大鼠稱質(zhì)量，經(jīng)

3%戊巴比妥鈉麻醉（40mg/kg腹腔內(nèi)注射），并給予阿托品0.1mg/kg腹腔注射。作氣管插管，接小動物呼吸機(jī)（江西省特力麻醉呼吸設(shè)備公司生產(chǎn)）。取前胸正中切口，在3～4肋間進(jìn)入胸腔，分離心包，從劍突下向胸腔方向及從兩側(cè)胸壁后方向上方適度擠壓，使心臟跳出胸腔，在右心室流出道與左心房之間，距主動脈根部2～3mm處用絲線（7-0）穿過左冠狀動脈前降支，在心肌梗死組連同一小束心肌一起結(jié)扎，以心臟表面顏色即刻變化，術(shù)后心電圖J點(diǎn)抬高判斷造模成功。然后逐層關(guān)胸。撤掉呼吸機(jī)，自主呼吸平穩(wěn)后，拔出氣管插管，逐層縫合。假手術(shù)組（Sham組）只穿線繞過冠狀動脈前降支而不結(jié)扎。術(shù)后大鼠保溫，單籠放置，待清醒后再次稱質(zhì)量，編號，按組分籠飼養(yǎng)。

1.2 分組和給藥方法：將術(shù)后48h存活的大鼠72只隨機(jī)分為Sham組、AMI對照組（AMI組，生理鹽水2mL·d-1灌胃）和螺內(nèi)酯（spirono1actone，Spi）治療組（Spi組，螺內(nèi)酯20mg·kg-1·d-1灌胃）。每組24只。

1.3 取材：3組分別于術(shù)后的48h，7、14、21d取材，用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，迅速開胸，取出心臟，冰上操作，4℃經(jīng)高壓處理的DEPC水中洗去殘余血液，剪取左心室非梗死區(qū)心肌組織約100mg，立即液氮速凍后，于-80℃中保存，用于RT-PCR檢測。

1.4 觀察指標(biāo)：用RT-PCR方法檢測大鼠非梗死區(qū)心肌組織Bc1-2mRNA和BaxmRNA表達(dá)，目的基因引物的合成，引物序列依據(jù)文獻(xiàn)報道設(shè)計(jì)，由上海生物工程公司合成。大鼠Bc1-2引物序列上游引物，5’-CAA GAA TGC AAA GCA CAT CC-3’，編號T12258，下游引物，5’-ATC CCA GCC TCCGTT ATC C-3’，編號T12259，PCR產(chǎn)物為702bp。大鼠Bax引物序列上游引物，5’-GGC TGG CAA GGC CTG GT-3’，編號T12057，下游引物，5’-AGC CAC AAA GAT GGT CAC TGT CT-3’編號T12058，PCR產(chǎn)物407bp。大鼠β-actin引物序列上游5’-GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA-3’，下游5’-GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG-3’，選自391～756bp，長為375個bp。提取大鼠心肌組織總RNA，并進(jìn)行完整性檢測。合成cDNA第一鏈，目的基因的PCR擴(kuò)增，用凝膠圖像分析系統(tǒng)（Ge1-Pro Ana1yzer Version 3.0）分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.3軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 螺內(nèi)酯對大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞 Bc1-2mRNA、BaxmRNA表達(dá)的影響：與Sham組相比較，AMI組和 Spi組大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞 Bc1-2 mRNA表達(dá)在 48h，7、14、21d均顯著降低（P＜0.01），Bax mRNA表達(dá)在48h，7、14、21d均顯著升高（P＜0.01）。與AMI組相比較，Spi組大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞Bc1-2mRNA表達(dá)在48h、7d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），14、21d均有所升高，分別升高15%（P＜0.05）、29%（P＜0.01）；BaxmRNA表達(dá)在48h、7d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），14、21d均有所降低，分別降低8%（P＜0.05）、30%（P＜0.01）。見表1，2。

表1 各組非梗死區(qū)心肌組織Bcl-2mRNA表達(dá)的變化（n=24，±s）

表1 各組非梗死區(qū)心肌組織Bcl-2mRNA表達(dá)的變化（n=24，±s）

*P＜0.01與Sham組比較 #P＜0.05 △P＜0.01與AMI組比較（q檢驗(yàn)）

Bc1-2mRNA組別48h 7d 14d 21d Sham組0.77±0.04 0.76±0.04 0.77±0.02 0.79±0.02 AMI組 0.28±0.02* 0.30±0.06* 0.47±0.06* 0.52±0.04*Spi組 0.29±0.02* 0.32±0.05* 0.54±0.04*# 0.67±0.06*△

表2 各組非梗死區(qū)心肌組織BaxmRNA表達(dá)的變化（n=24，±s）

表2 各組非梗死區(qū)心肌組織BaxmRNA表達(dá)的變化（n=24，±s）

*P＜0.01與Sham組比較 #P＜0.05 △P＜0.01與AMI組比較（q檢驗(yàn)）

BaxmRNA 組別48h 7d 14d 21d Sham組0.30±0.03 0.28±0.03 0.30±0.02 0.30±0.02 AMI組 0.89±0.04* 0.88±0.06* 0.69±0.03* 0.60±0.02*Spi組 0.90±0.05* 0.81±0.07* 0.64±0.04*# 0.42±0.05*△

3 討 論

3.1 AMI后心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bc1-2mRNA和BaxmRNA表達(dá)的變化：研究［2］表明，心肌細(xì)胞凋亡是使心肌梗死范圍擴(kuò)大的一個獨(dú)立因素。而細(xì)胞凋亡受多種基因、蛋白質(zhì)、生長因子的調(diào)控，Bc1-2家族是目前研究最深入的調(diào)控因子之一。Bc1-2家族的成員能將準(zhǔn)確地感受細(xì)胞所受到的刺激信號并整合，從而決定細(xì)胞是否凋亡［3］。本研究顯示，大鼠 AMI后在AMI組48h，7、14、21d非梗死區(qū)Bc1-2mRNA表達(dá)明顯降低，BaxmRNA表達(dá)明顯增加。表明在AMI后心肌細(xì)胞凋亡中Bc1-2家族起重要作用。可能機(jī)制為Bc1-2基因通過防止受損的DNA激活凋亡的誘導(dǎo)基因來防止細(xì)胞凋亡［4］。有研究［5］認(rèn)為，Bc1-2家族的Bax同源二聚體導(dǎo)致線粒體Ca2+內(nèi)流及細(xì)胞色素C外流的PTT交換通道，引起細(xì)胞凋亡。Bc1-2也可與Bax結(jié)合，Bax表達(dá)水平增加可拮抗Bc1-2的作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bc1-2也可能通過抗氧化作用或抑制氧自由基的產(chǎn)生抑制細(xì)胞凋亡。也有研究［6］認(rèn)為Bc1-2基因是通過細(xì)胞內(nèi)二磷酸鳥苷含量增加而實(shí)現(xiàn)抗凋亡的。Bc1-2與Bax調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡不僅取決于自表達(dá)的高低，而且還與Bc1-2/Bax比值有關(guān)，當(dāng)比值減小時促進(jìn)細(xì)胞凋亡，反之抑制細(xì)胞凋亡。

3.2 螺內(nèi)酯對大鼠AMI后心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bc1-2和Bax表達(dá)的影響：本研究顯示，Spi組與AMI組相比，隨時間的延長Bc1-2基因表達(dá)逐漸增加，Bax基因表達(dá)逐漸減低，提示螺內(nèi)酯可能通過增加Bc1-2基因表達(dá)，減弱Bax基因表達(dá)，而抑制心肌細(xì)胞凋亡。本文通過從細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)來闡明其對心室重構(gòu)的有益作用。螺內(nèi)酯可減低Bax基因表達(dá)，增加Bc1-2基因表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心室重構(gòu)。可能機(jī)制為，降低醛固酮水平，減輕醛固酮所致的心室重構(gòu)作用，醛固酮有不依賴血管緊張素Ⅱ的獨(dú)立作用，尤其是可以改善心室重構(gòu)和血管重塑［7］；減低了血漿和心臟局部的醛固酮水平，從而減弱血管緊張素Ⅱ的效應(yīng)，醛固酮受體拮抗劑通過降低心臟局部醛固酮水平下調(diào)AT1受體密度減弱血管緊張素Ⅱ的效應(yīng)，從而減弱AngⅡ與AT1受體結(jié)合，通過激活三磷酸肌酸途徑減弱cfos、c-jun、c-myc等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，并降低由此介導(dǎo)的Bax基因表達(dá)水平，同時增加Bc1-2基因表達(dá)；減輕氧化應(yīng)激，螺內(nèi)酯通過減弱AMI后氧化應(yīng)激，抑制應(yīng)激活化蛋白激酶JNK（JNK是絲裂素活化蛋白酶家族主要成員之一）途徑引起細(xì)胞凋亡和Bc1-2基因表達(dá)減弱，使Bc1-2基因表達(dá)增加抑制細(xì)胞凋亡；抑制某些細(xì)胞因子表達(dá)，醛固酮受體拮抗劑通過抑制某些細(xì)胞因子（如腫瘤壞死因子-α［8］、轉(zhuǎn)化生長因子-β）表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡并增加Bc1-2表達(dá)，醛固酮受體拮抗劑通過減輕容量負(fù)荷而增加Bc1-2表達(dá)、降低Bax表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡；螺內(nèi)酯可減輕心肌損傷邊緣部位尚存心肌細(xì)胞早期凋亡，可能是通過改善心肌細(xì)胞線粒體功能，從而抑制細(xì)胞凋亡［9］。

大鼠AMI死后，非梗死區(qū)心肌細(xì)胞發(fā)生了凋亡，同時伴有凋亡相關(guān)基因Bc1-2的低表達(dá)及Bax的高表達(dá)；螺內(nèi)酯治療可增加AMI后大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bc1-2的表達(dá)和減弱Bax的表達(dá)，從而減少心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步抑制心室重構(gòu)。

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（本文編輯：劉斯靜）

R542.22

B

1007-3205（2012）04-0431-03

2012-01-17；

2012-02-28

許香梅（1975-），女，河北大名人，河北石家莊市第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事心血管內(nèi)科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.04.021