老年肥胖者脂肪組織內脂素基因的表達及其相關因素

蔣藍英，趙 凱，付仲穎，董 斌，孫文麗，何炳榮

（浙江省杭州市紅十字會醫院老年病科，浙江杭州 310003）

老年肥胖者脂肪組織內脂素基因的表達及其相關因素

蔣藍英，趙 凱，付仲穎，董 斌，孫文麗，何炳榮

（浙江省杭州市紅十字會醫院老年病科，浙江杭州 310003）

目的探討老年肥胖患者腹部網膜及皮下脂肪組織內脂素mRNA的表達情況及其相關因素。方法根據體質量指數不同，將擇期腹部手術的老年患者40例分為肥胖組20例，對照組20例。采用實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應方法檢測內脂素mRNA的表達量，酶聯免疫吸附法測定血漿內脂素濃度，穩態模型評估胰島素抵抗指數（homeostasis mode1 of assessment for insu1in resistant index，HOMA-IR），并分析內脂素與人體測量指標和代謝指標的相關性。結果①2組網膜脂肪組織內脂素mRNA的表達量明顯高于皮下脂肪組織內脂素mRNA的表達量（P＜0.05），肥胖組網膜脂肪組織內脂素mRNA的表達量高于對照組（P＜0.05），而2組皮下脂肪組織內脂素mRNA的表達量差異無統計學意義（P＞0.05）；②肥胖組血漿內脂素濃度顯著高于對照組（P＜0.05）；③合并2組數據，網膜脂肪組織內脂素mRNA的表達水平與腰臀比、空腹胰島素、HOMA-IR呈正相關（r=0.264、0.108、0.173，P＜0.05），而皮下脂肪組織未發現任何相關性因素（r=0.099，P＞0.05）；血漿內脂素濃度與總膽固醇呈正相關（r=0.257，P＜0.05），且與網膜脂肪組織內脂素mRNA的表達水平呈正相關（r=0.267，P＜0.05）；④多元逐步回歸分析發現，空腹胰島素是血漿內脂素濃度和網膜脂肪組織內脂素mRNA的獨立相關因素。結論內脂素mRNA主要在內臟脂肪組織中表達，可能與肥胖、胰島素抵抗有關。

肥胖癥；內脂素；脂肪組織；老年人

脂肪組織是一個活躍的內分泌器官，能分泌多種脂肪細胞因子，如腫瘤壞死因子α、纖溶酶原激活抑制因子-1、白細胞介素-6、瘦素、抵抗素以及脂聯素等，在能量代謝平衡以及多種疾病中發揮著重要的作用［1-2］。內脂素是新近發現的一種新的脂肪細胞因子，主要由內臟脂肪分泌產生，其具有類胰島素活性，可降低血糖并能促進脂肪的合成與聚集，因此可能是與肥胖有關的一個肽類激素［3］。本研究觀察內脂素基因在老年肥胖者和對照者腹部皮下脂肪組織和網膜脂肪組織中表達情況的差異及其與體質量指數（body mass index，BMI）、腰圍、血壓、空腹血糖（fasting b1ood g1ucose，FBG）、空腹胰島素（fasting insu1in，FINS）、血脂、穩態模型評估胰島素抵抗指數（homeostasis mode1 of assessment for insu1in resistance index，HOMA-IR）、血漿內脂素的關系，探討內脂素在老年肥胖者和胰島素抵抗中的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：2009年1—12月浙江省杭州市紅十字會醫院因膽石病、慢性膽囊炎、肝血管瘤等擇期腹部手術的老年患者40例，排除惡性腫瘤、急性炎癥患者，無使用糖皮質激素、性激素、胰島素、降脂藥等藥物病史。采用2000年亞太地區成人肥胖的分類標準［4］，BMI≥25kg/m2為肥胖，≤23kg/m2為正常體質量，其中肥胖組20例，男性14例，女性6例，年齡60～77歲，平均（65.0±3.7）歲；對照組（正常體質量）20例，男性14例，女性6例，年齡60～78歲，平均（64.8±3.0）歲。均簽署知情同意書，在手術過程中取花生米大小的皮下脂肪和大網膜脂肪各1塊，-80℃液氮迅速凍存，用于RNA提取。

1.2 內 脂 素：mRNA 檢 測 用 TRIZOL（INVITROGEN公司）提取脂肪組織總RNA，UV-754紫外發光光度計測定其濃度和含量，標本總RNA A260與A280比值均為1.8～2.0。依據逆轉錄試劑盒（TAKARA日本）說明操作，獲取cDNA后，用無RNase的DNase處理，去除可能的基因組DNA污染。引物的設計與合成，根據Genbank上報道的人內脂素基因與 β-actin基因序列［3］，利用Primer-5引物設計軟件設計。以肌動蛋白（βactin）基因作為內參照基因，其引物（186bp），上游，5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’；下游，5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’。內脂素為目的基因，其引物（216bp），上游，5’-TCCTGGCCACCGACTCCTA -3’；下游，5’-TTTGGCTTCCTGGATTTTCTCT-3ˋ引物由浙江熒光泰生物技術公司合成。

實時熒光定量PCR反應體系，SYBRRGreen I PCR Master Mix 12.5μL，10μmo1/L上下游引物各0.5μL，模板 2.0μL，總體積為25μL；以 NTC（no temp1ate contro1）、NRTC（no reverse-transcript contro1）為陰性對照。反應條件，95℃5 min，94℃、15s→60℃、45s，循環擴增40次，60℃測定熒光值，熔解曲線，儀器為美國ABI的ABI 7500型實時熒光定量PCR儀，結果由儀器配套的軟件分析，采用比較閾值法來測定目的基因的相對表達，目的基因的相對表達量 =2t-△△C，△△Ct=（△Ct，目的基因-△Ct，內參基因）實驗組-（△Ct，目的基因-△Ct，內參基因）對照組。

C（tthresho1dcyc1e）值為PCR反應時，隨著PCR產物逐漸增多，熒光強度不斷增強，當達到一定的閾值被儀器檢測到時的循環數。2t-△△C表示的是肥胖組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數，使用這一方法可以直接得到目的基因相對于內參基因的定量。

1.3 測量指標：血壓（mmHg）、身高（m）、體質量（kg）、腰圍（waist circumference，WC）（cm）、臀圍（hip circumference，HC）（cm），計算BMI及腰臀比（waist to hip ratio，WHR），BM1=體質量（kg）/身高（m）2；WHR=腰圍（cm）/臀圍（cm）。

1.4 血液標本的收集及測定：患者隔夜空腹10～12h采集靜脈血，一份血清立即測定FPG、FINS、血脂，一份加入乙二胺四乙酸抗凝管混勻，立即送實驗室，4℃離心（3 500r/min）3min，分離的血漿凍存于-80℃冰箱，用于血漿內脂素濃度測定。血漿內脂素濃度測定，采用ELISA法，線性范圍為4～256μg/L，批內變異系數（coefficient of variation，CV）＜5%，批間CV＜14%。用Curve Expert 1.3軟件制作半對數標準曲線圖并處理數據，得到標本血漿內脂素濃度。血脂測定，總膽固醇（tota1 cho1estero1，TC）、三酰甘油（trig1yceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity 1ipoprotein cho1estero1，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（1ow-density 1ipoprotein cho1estero1，LDLC）采用酶法測定；FPG測定采用葡萄糖氧化酶一過氧化物酶酶聯法，由日本奧林巴斯AU1000全自動生化分析儀檢測。FINS測定化學發光法，由德國羅氏E-170型全自動電化學發光分析儀檢測。糖化血紅蛋白測定采用高壓液相。

1.5 統計學方法：應用SPSS17.0統計軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，兩樣本間比較采用獨立樣本t檢驗和配對t檢驗，相關性采用直線相關分析和多元線性逐步回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床參數及生化資料比較：肥胖組BMI、WC、WHR、FINS、HOMA-IR、TG、血漿內脂素（visfastin）濃度顯著高于對照組（P＜0.01，P＜0.05），2組年齡、收縮壓（systo1ic b1ood pressure，SBP）、舒張壓（diasto1ic b1ood pressure，DBP）、FBG、TC、LDL-C、HDL-C差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 肥胖組和對照組臨床與實驗室參數比較Table 1 Analysis of clinic and laboratory data between obesity group and control group（n=20，±s）

表1 肥胖組和對照組臨床與實驗室參數比較Table 1 Analysis of clinic and laboratory data between obesity group and control group（n=20，±s）

*P＜0.05 #P＜0.01 vs contro1 group by t testBMI：body mass index；WC：waist circumference；WHR：waist-hip ratio；SBP：systo1ic b1ood pressure；DBP：diasto1ic b1ood pressure；FBG：fasting b1ood g1ucose；FINS：fasting insu1in；HOMA-IR：homeostasis mode1 of assessment for insu1in resistence index；TC：tota1 cho1estero1；TG：trig1yceride；LDL-C：1ow-density 1ipoprotein cho1estero1；HDL-C：high-density 1ipoprotein cho1estero1

Groups Age（years）BMI［m·A/kg·（m2）-1］ （L/cm） WHR SBP（P/mmHg）WC DBP（P/mmHg）FBG（c/mmo1·L-1）.02 133.4±11.6 77.8±5.7 5.45±0.86 Obesity 65.6±7.3 25.98±0.80# 89.0±2.4# 0.91±0.06#Contro1 64.8±8.0 21.97±0.79 79.1±3.4 0.88±0 135.6±7.8 76.4±5.1 5.81±0.76 Groups FINS（mU/L） HOMA-IR TC（c/mmo1·L-1）TG（c/mmo1·L-1）LDL-C（c/mmo1·L-1）HDL-C（c/mmo1·L-1）Visfastin（ρ/μg·L-1）±0.29 3.00±0.76 1.20±0.19 16.54±2.54 Obesity 14.06±3.32# 3.67±1.15# 5.13±0.71 1.78±0.31* 3.19±0.74 1.13±0.22 18.16±2.93 Contro1 11.41±1.18 2.77±0.57 4.92±0.77 1.60 *

2.2 內脂素mRNA實時定量PCR：與皮下脂肪組織內脂素mRNA表達量相比，對照組及肥胖組網膜脂肪組織內脂素mRNA表達量均明顯增高（P＜0.05），肥胖組網膜脂肪組織內脂素mRNA表達量顯著高于對照組（P＜0.05），而肥胖組與對照組皮下脂肪組織內脂素mRNA表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2，圖1。

2.3 相關性分析：血漿內脂素與TC（r=0.257，P＜ 0.05）、網膜脂肪組織內脂素 mRNA表達量（r= 0.279，P＜0.05）呈正相關，而與皮下脂肪組織內脂素mRNA表達量無相關性（r=0.099，P＞0.05）；皮下脂肪組織內脂素mRNA表達量與網膜脂肪組織內脂素mRNA的表達量呈正相關（r=0.771，P＜0.01），網膜脂肪組織內脂素 mRNA表達量與WHR、FINS、HOMA-IR呈正相關（r=0.264、0.108、0.173，P＜0.05）。

表2 肥胖組和對照組內脂素mRNA實時熒光定量PCR結果Table 2 The results of adipose tissue visfatin mRNA expression using real time PCR in obesity and control groups（n=20，±s）

表2 肥胖組和對照組內脂素mRNA實時熒光定量PCR結果Table 2 The results of adipose tissue visfatin mRNA expression using real time PCR in obesity and control groups（n=20，±s）

*P＜0.05 vs subcutaneous adipose tissue #P＜0.05 vs omenta1 adipose tissue in contro1 group by t test

Groups Ctβ-actin Ctvisfatin △Ct △△Ct 2-△△Ct（95%CI）Subcutaneous adipose tissue Contro1 21.39±1.29 31.87±1.34 10.47±0.72 0.00±0.72 1.0（0.61～1.65）Obesity 21.42±1.12 31.94±1.40 10.51±0.63 0.05±0.63 0.97（0.67～1.60）Omenta1 adipose tissue Contro1 21.37±1.22 30.26±1.25 8.89±0.60 -1.57±0.89 2.97（1.60～5.50）*Obesity 21.41±1.23 29.85±1.21 8.48±0.50 -1.98±0.93 3.94（1.04～7.52）*#

圖1 各脂肪組織相對于對照組皮下脂肪組織內脂素mRNA表達示意圖A.對照組皮下；B.肥胖組皮下；C.對照組網膜；D.肥胖組網膜脂肪組織*P＜0.05與對照組皮下脂肪組織內脂素比較 #P＜0.05與對照組網膜脂肪組織mRNA比較（t檢驗）Figure 1 Visfatin mRNA expressions of different adipose tissue compared to subcutaneous adipose tissue of contro1A.Subcutaneous adipose tissue in contro1 group；B.Subcutaneous adipose tissue in obesity group；C.Omenta1 adipose tissue in contro1 group；D. Omenta1 adipose tissue in obesity group*P＜0.05 vs expression of visfatin mRNA in subcutaneous adipose tissue in contro1 group #P＜0.05 vs expression of visfatin mRNA in omenta1 adipose tissue in contro1 group by t test

2.4 多元逐步回歸分析：以年齡、BMI、WC、WHR、SBP、DBP、FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、HDL-C為自變量，分別以血漿內脂素濃度、皮下脂肪組織內脂素mRNA表達量、網膜脂肪組織內脂素mRNA表達量作為因變量，進行多元線性逐步回歸分析，顯示FINS是血漿內脂素濃度和網膜脂肪組織內脂素mRNA的獨立相關因素（r=0.619、0.267，P＜0.01，P＜0.05）。

3 討 論

肥胖癥是一種以體脂的過度堆積和異常分布為特征的內分泌代謝疾病，可增加2型糖尿病、高血壓和冠心病等相關疾病的危險性，已逐漸成為21世紀影響人們健康的主要問題之一。流行病學證據顯示，網膜脂肪較皮下脂肪堆積具有更大的危險性［5］，因此體脂的分布可能比體脂的總量顯得更為重要。

內脂素是新發現的一個脂肪細胞因子，具有擬胰島素活性，可降低血糖并能促進脂肪的合成與聚集。近年來發現內脂素與網膜脂肪含量強相關［6］，表明與腹型肥胖關系密切。本研究針對老年人群，系統研究了老年肥胖人群網膜及皮下脂肪組織中內脂素mRNA表達的差異以及與體脂、血脂、血糖、胰島素等指標的相關性。

本結果顯示，老年肥胖組和對照組網膜脂肪組織內脂素mRNA的表達顯著高于皮下脂肪組織，且肥胖組網膜脂肪組織內脂素mRNA的表達明顯高于對照組，而2組皮下脂肪組織內脂素mRNA的表達差異無統計學意義；另外，血漿內脂素的濃度與網膜脂肪組織內脂素mRNA的表達水平呈正相關，而與皮下脂肪組織內脂素mRNA的表達水平沒有相關性。均提示內脂素主要在內臟脂肪組織中表達，與Fukuhara等［3］研究結果一致。

本文老年肥胖組血漿內脂素濃度顯著高于對照組；網膜脂肪組織mRNA的表達水平與WHR呈正相關，而皮下脂肪組織內脂素mRNA的表達水平與此無明顯相關。Chen等［7］發現內脂素與WHR呈正相關，且WHR是血漿內脂素水平的獨立相關因素，這也進一步提示內脂素與內臟脂肪之間存在緊密聯系，即內臟脂肪的含量越多，內脂素基因表達水平越高。本文肥胖組TC濃度顯著高于對照組，相關分析顯示血漿內脂素濃度與TC呈正相關，提示血漿內脂素與腹型肥胖、脂代謝紊亂有關。

本組網膜脂肪組織內脂素mRNA表達水平與FINS、HOMA-IR呈正相關，多元線性逐步回歸分析，空腹胰島素是血漿內脂素濃度和網膜脂肪組織內脂素mRNA表達水平的獨立相關因素，提示網膜脂肪組織內脂素基因表達與FINS水平相關，與胰島素抵抗有一定的相關性。因內脂素的特征與胰島素有相同之處，所以對內脂素的生理作用的進一步研究可能對糖代謝穩定產生新的認識，為糖尿病的治療找到新的方法。

但國外有關內脂素的研究亦有不同的結論。K1oting等［8］對肥胖WOKW大鼠與消瘦DA大鼠進行研究，發現兩者內脂素mRNA表達水平差異無統計學意義，且未發現其在肥胖WOKW大鼠與消瘦DA大鼠的內臟脂肪中上調。Berndt等［9］研究發現，血漿內脂素濃度與網膜脂肪量之間無相關性，皮下脂肪與網膜脂肪內脂素基因表達水平差異無統計學意義。Bottcher等［10］進行的內脂素基因多態性與糖、脂代謝相關性研究中發現，內脂素基因的變化在2型糖尿病、肥胖等疾病的發生中作用不大。考慮與各研究者選擇的實驗對象及樣本量不同、實驗方法不一致有關。總之，對老年肥胖患者內脂素基因表達水平和血漿濃度變化的研究表明，該脂肪細胞因子與肥胖的發生發展有關，可能在脂質代謝紊亂所引起疾病的發生發展中起作用，但其作用機制還需進一步研究。

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（本文編輯：趙麗潔）

EXPRESSION OF VISFATIN mRNA IN ADIPOSE TISSUES AND RELATED FACTORS IN SENILE OBESITY SUBJECTS

JIANG Lanying，ZHAO Kai，FU Zhongying，DONG Bin，SUN Wen1i，HE Bingrong
（ Department of Gerontologt，Hangzhou Red Cross Hospital，Zhejiang Province，Hangzhou 310003，China）

ObjectiveTo investigate the expression of visfatin mRNA in subcutaneous and omenta1 adipose tissue and re1ated factors in seni1e obesity subjects.MethodsForty seni1e patients of surgery were divided into obese group and norma1 group（n=20 for each）according to body mass index. The expression of visfatin mRNA in abdomina1 subcutaneous and omenta1 adipose tissue was measured by rea1-time f1uorescent quantitative reverse transcription-po1ymerase chain reaction（RT-PCR）assay，p1asma visfatin was measured by enzyme-1inked immunosorbent assay（ELISA），and fasting b1ood g1ucose，fasting insu1in（FINS），b1ood 1ipid profi1es and homeostasis mode1 of assessment for insu1in resistant index（HOMA-IR）were determined.Results①There was no statistica1 difference of visfatin mRNA expression in subcutaneous adipose tissue between obese subjects and contro1s.Visfatin mRNA expression 1eve1s in omenta1 adipose tissue were significant1y increased in obese subjects and contro1s than those in subcutaneous tissue respective1y（P＜0.05），visfatin mRNA expression in omenta1 adipose tissue was significant1y higher in obese group than in contro1 group，and visfatin mRNA expression was not significant1y different between obese subjects and contro1s.②P1asma visfatin 1eve1s were e1evated in obesesubjects compared with contro1s（P＜0.05）.③The expression 1eve1 of visfatin mRNA in a11 omenta1 adipose tissue was positive1y corre1ated with waist-hip ratio，fasting insu1in，HOMA-insu1in resistance. However the expression 1eve1 of visfatin mRNA in a11 subcutaneous adipose was not corre1ated with any factors.P1asma visfatin 1eve1s were positive1y corre1ated with tota1 cho1estero1 and visfatin mRNA expression 1eve1s in omenta1 adipose tissue.④Mu1ti-stepwise regression ana1ysis demonstrated that the expression 1eve1 of visfatin mRNA in a11 omenta1 adipose tissue and p1asma visfatin 1eve1s were significant1y corre1ated with FINS.ConclusionVisfatin mRNA expression is main1y in omenta1 adipose tissues and may be re1ated to obesity or insu1in resistance.

obesity；visfatin；adipose tissue；aged

R589.2

A

1007-3205（2012）04-0386-05

2011-11-04；

2011-12-28

浙江省杭州市醫藥衛生科技計劃項目（2007B0045）

蔣藍英（1979-），女，浙江義烏人，浙江省杭州市紅十字會醫院主治醫師，醫學碩士，從事內分泌代謝性疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.04.005