高發區早期食管癌蛋白指紋圖譜模型的建立及其篩查價值

于衛芳，牛巍巍，李 超，張立瑋，王士杰

（1.河北醫科大學第一醫院內鏡中心，河北石家莊 050031；2.河北醫科大學第四醫院內鏡室，河北石家莊 050011）

·論 著·

高發區早期食管癌蛋白指紋圖譜模型的建立及其篩查價值

于衛芳1，牛巍巍1，李 超1，張立瑋2*，王士杰2

（1.河北醫科大學第一醫院內鏡中心，河北石家莊 050031；2.河北醫科大學第四醫院內鏡室，河北石家莊 050011）

目的建立高發區早期、進展期食管癌的蛋白指紋圖譜模型并探究篩查價值。方法使用飛行質譜技術檢測高發區內鏡篩查的38例正常對照、15例早期食管癌和36例進展期食管癌患者的血清蛋白質譜，支持向量機分別建立蛋白指紋圖譜模型，留一法交叉驗證判別效果。結果區分早期食管癌和正常對照的蛋白指紋圖譜模型特異性為81.58%，敏感性為80.00%；區分進展期食管癌和正常對照的模型特異性為89.47%，敏感性為83.33%；區分早期食管癌和進展期食管癌的模型特異性為73.33%，敏感性為91.67%。質荷比峰4 291、4 392、4 823、4 975、5 644、5 665、5 932、8 473、8 776、8 910Da的表達量組間比較差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結論3個蛋白指紋圖譜模型的建立，為篩查高發區早期食管癌提供了一種新方法；構建模型的質荷比峰可能是早期食管癌的潛在生物學標記物。

食管腫瘤；肽譜；普查

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取河北省食管癌高發區磁縣和涉縣的40～69歲研究對象89例，男性48例，平均（57.42±9.60）歲，女性41例，平均（57.68±9.74）歲。均行電子胃鏡檢查結合碘染色指示性活檢，并經2位組織病理學專家確診。其中正常對照組38例，早期食管癌組15例和進展期食管癌組36例。

1.2 儀器與試劑：采用美國 Ciphergen Biosystems公司生產的PBSⅡc型飛行質譜儀及CM10蛋白芯片（弱陽離子交換芯片）對血清標本進行蛋白質譜分析。SPA（sinapinic acid）試劑購自美國F1uka公司。尿素、乙腈、CHAPS、三羥甲基氨基甲烷藍酸鹽等試劑購自美國Sigma公司。

1.3 蛋白芯片分析：全部研究對象于清晨空腹抽取靜脈血2mL，室溫靜置2h后，5 000r/min離心5min（重復操作2次），提取血清-80℃保存。血清樣本冰上融解，4℃ 10 000r/min離心4min，留取上清液。取96孔板放置在冰盒上，每孔上加10μL U9緩沖液（9mo1/L Urea 2.7g溶于2mL去離子水中，2%CHAPS 0.1g，1%二硫蘇糖醇0.05g，定容到5mL），每孔分別再加5μL血清，放入層析柜4℃振蕩30min。U9緩沖液處理后96孔板放冰上，快速加入185μL醋酸鈉（100mmo1/L，pH4.0）溶液，層析柜中4℃振蕩2min。CM10芯片通過加200μL醋酸鈉溶液活化，在層析柜中振蕩5min（重復1次）。加100μL處理好的樣本到芯片上，去除氣泡后于層析柜中600r/min 4℃振蕩1h后，拍干。加入200μL醋酸鈉沖洗重復3次，拍干。加去離子水200μL連續2次，拍干。SELDI-TOF-MS分析前，加50%飽和SPA溶液1μL，5min后再點1μL，干燥后行表面增強激光解吸電離飛行時間質譜技術（surface enhanced 1aser desorption/ionization time of f1ight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）檢測。

1.4 數據處理：SELDI-TOF-MS儀的校準依據Ciphergen公司的“一體化肽分子質譜標準”。激光強度設為180，靈敏度為7，收集數據的最高相對分子質量100 000，優化相對分子質量范圍是2 000～20 000。采用浙江大學腫瘤所設計的蛋白芯片數據分析系統（ZUCI-Protein Chip Data Ana1yze System）軟件包對質譜數據行過濾噪音、聚類分析和強度均一化處理。本組設13例質量控制樣本（取自同一標準血清樣本），隨機分布在實驗樣本中進行檢測。峰值大小和強度變異系數（coefficient of variance，cv）值分別為0.05%和19.7%。

1.5 生物信息學分析：應用支持向量機算法。采用徑向基核函數，Gamma值設為0.6，罰分函數設為19。特征向量的選取采用統計過濾結合模型依賴性篩選的方法。對質荷比峰值做Wi1conxon秩和檢驗，選出P值最小的10個峰進一步分析。將10個峰的任意組合用于支持向量機模型的輸入，選出約登指數最高的組合建立蛋白指紋圖譜模型作為最終結果。用留一法交叉驗證評估模型判別效果，其原理是每次留下一個樣本作為測試，其余樣本作為訓練組，重復操作直到每例樣本均被作為一次測試樣本為止。

1.6 統計學方法：應用 ZUCI-ProteinChip Data Ana1yze System軟件進行分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 區分早期食管癌與正常對照組血清蛋白指紋圖譜模型的建立：使用SELDI-TOF-MS儀分析38例正常對照與15例早期食管癌的血清蛋白質譜。在進行降噪處理和峰值鑒別后，在相對分子質量2 000～20 000范圍內，共檢測到137個蛋白質荷比峰。采用支持向量計算法篩選出3個質荷比峰（M/ Z值為3 896、4 823、7 795Da），建立區分早期食管癌與正常對照組的血清蛋白指紋圖譜模型，經留一法交叉驗證，其特異性為81.58%，敏感性為80.00%。其中4 823Da在早期食管癌組和正常對照組中表達差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1，圖1。

表1 早期食管癌組和正常對照組3個質荷比峰表達量比較Table 1 Comparison of expression of protein peaks between early esophageal cancer and normal control（±s，Da）

表1 早期食管癌組和正常對照組3個質荷比峰表達量比較Table 1 Comparison of expression of protein peaks between early esophageal cancer and normal control（±s，Da）

*P＜0.05 vs norma1 contro1 by t test

Groups n Protein peak（M/Z）3 896 4 823 7 795 Norma1 contro1 38 595.44±296.94 597.54±363.01 648.79±291.61 Ear1y esophagea1 cancer 15 720.31±288.86 422.82±108.43*830.59±356.30

圖1 模型中3個質荷比峰的質譜圖（M/Z值為3 896、4 823、7 795Da）0.正常對照組；1.早期食管癌組Figure 1 Mass spectrum of three protein peaks in protein fingerprint mode1 0.Norma1 contro1 group；1.Ear1y esophagea1 cancer group

2.2 區分進展期食管癌與正常對照組血清蛋白指紋圖譜模型的建立：使用SELDI-TOF-MS儀分析38例正常對照與36例進展期食管癌血清蛋白質表達譜，共檢測到140個蛋白質荷比峰，其中17個峰表達量的差異有統計學意義（P＜0.01）。采用支持向量計算法篩選出由6個質荷比峰（M/Z值為4 291、4 975、5 644、5 665、5 932、8 776Da）構建的蛋白指紋圖譜模型，經留一法交叉驗證，其特異性為89.47%，敏感性為83.33%。其中4 975、5 644、5 665、5 932 Da在進展期食管癌組中表達顯著高于正常對照組（P＜0.01）。見表2，圖2。

表2 進展期食管癌組和正常對照組6個質荷比峰表達量比較Table 2 Comparison of expression of protein peaks between advanced esophageal cancer and normal control（±s，Da）

表2 進展期食管癌組和正常對照組6個質荷比峰表達量比較Table 2 Comparison of expression of protein peaks between advanced esophageal cancer and normal control（±s，Da）

*P＜0.01 vs norma1 contro1 by t test

Groups n Protein peak（M/Z）4 291 4 975 5 644 5 665 5 932 8 776 Norma1 contro1 38 2 311.11±731.92 617.73±397.99 3 082.75±1 051.75 408.08±152.02 870.01±558.95 2 400.89±666.98 Advanced esophagea1 cancer 36 1 752.79±691.59* 1 215.47±993.19* 5 265.85±2 423.57* 570.56±215.96* 1 592.07±1 037.80* 1 761.91±627.82*

圖2 模型中6個質荷比峰的質譜圖（M/Z值為4 291、4 975、5 644、5 665、5 932、8 776Da）0.正常對照組；1.進展期食管癌組Figure 2 Mass spectrum of six protein peaks in protein fingerprint mode10.Norma1 contro1 group；1.Advanced esophagea1 cancer group

2.3 區分早期食管癌和進展期食管癌血清蛋白指紋圖譜模型的建立：使用SELDI-TOF-MS儀分析比較15例早期食管癌和36例進展期食管癌患者的血清蛋白質表達譜，共檢測到145個蛋白質荷比峰，其中13個差異有統計學意義（P＜0.05）。支持向量計算法篩選出由5個質荷比峰（M/Z值為4 290、 4 392、5 643、8 473、8 910Da）構建的診斷模型，其特異性為73.33%，敏感性為91.67%。其中4 290、4 392、8 473、8 910Da在早期食管癌組中高表達，而在進展期食管癌組中低表達；5 643Da與之相反。見表3，圖3。

表3 早期食管癌組和進展期食管癌組5個質荷比峰表達量比較Table 3 Comparison of expression of protein peaks between early esophageal cancer and advanced esophageal cancer（±s，Da）

表3 早期食管癌組和進展期食管癌組5個質荷比峰表達量比較Table 3 Comparison of expression of protein peaks between early esophageal cancer and advanced esophageal cancer（±s，Da）

*P＜0.05 vs ear1y esophagea1 cancer by t test

4 290 4 392 5 643 8 473 8 910 Ear1y esophagea1 cancer 15 2 492.76±1 115.43 828.94±227.70 4 007.62±1 809.47 1 117.39±80 Groups n Protein peak（M/Z）3.35 2 764.72±820.30 Advanced esophagea1 cancer 36 1 823.25±711.48* 633.46±197.39* 5 471.47±2 495.49* 624.25±548.82* 2 227.13±770.76*

圖3 模型中5個質荷比峰的質譜圖（M/Z值為4290、4392、5643、8473、8910Da）0.早期食管癌組；1.進展期食管癌組Figure 3 Mass spectrum of six protein peaks in protein fingerprint mode10.Ear1y esophagea1 cancer group；1.Advanced esophagea1 cancer group

3 討 論

隨著人類基因組計劃的完成，蛋白質組學逐漸成為生物領域的主要研究方向。蛋白質能直接反應基因信息，其表達譜能更直觀地反映生物體功能變化。在腫瘤發展的早期階段，即可出現一些蛋白在質和量上的改變，均可能成為腫瘤早期診斷的預警分子指標。傳統蛋白研究技術（如色譜分離純化、二維電泳等）儀器昂貴、步驟繁瑣，不適應大規模的篩查和臨床檢測。SELDI-TOF-MS，又稱為蛋白指紋圖譜技術，是近年興起的一項差異蛋白組學技術，可以快速、高通量地檢測微量粗制樣本蛋白圖譜，篩選出腫瘤特異性低豐度蛋白，有望提高腫瘤篩檢的特異性和敏感性。目前，應用SELDI-TOFMS技術研究消化道腫瘤，已經成功地建立了食管晚期癌［2］、賁門癌［3］、大腸癌［4］和胰腺癌［5］的蛋白指紋圖譜模型，其敏感性和特異性均較高。目前，受到標本量的限制，對于早期食管癌的研究少見報道。

鑒于腫瘤發生演變因素的復雜性，檢測單一或數個指標對食管癌進行早期診斷不可避免地存在敏感性和特異性矛盾。因此，許多學者開始嘗試使用多標志物聯合檢測技術來提高篩檢的敏感性和特異性，雖取得一些進展，但尚不能全面反映出癌變過程多種因子的復雜變化［6］。本研究采用 SELDITOF-MS技術對高發區內鏡篩查出的早期和進展期食管癌及正常對照血清蛋白表達譜進行對比分析，提供了一組蛋白質的功能及其模式的信息，通過計算機軟件的統計學處理，篩選出多種候選腫瘤標志物建立診斷模型，優于以往采用單一標志物或多標志物簡單疊加進行檢測的篩查方法，能較全面的反映癌變過程多因子變化情況，對其聯合檢測可大幅提高其特異性和敏感性。本研究結果表明，早期、進展期食管癌分別與正常對照組比較建立的血清蛋白指紋圖譜模型能良好區分來自高發區的食管癌和正常對照，具有較高的特異性（81.58%、89.47%）和敏感性（80.00%、83.33%），為高發區高危人群中食管癌的早期篩查和診斷提供了一種新方法。

早期食管癌的術后5年生存率可達90%以上，遠高于進展期食管癌［7］。由于早期和進展期食管癌的治療方案、治療效果、術后生存質量迥異，區分不同病理階段的食管癌顯得尤為重要。本研究建立的區分早期食管癌和進展期食管癌的血清蛋白指紋圖譜模型，能良好地區分早期和進展期食管癌，特異性（73.33%）和敏感性（91.67%）均較高，該模型如能在臨床應用，可為食管癌治療方案的選擇提供依據。

目前，高發區早期食管癌的診斷主要依賴內鏡結合碘染色技術，篩查成本較高、人群耐受性較差、操作耗時較長，難以在大人群中推廣應用。因此，研究腫瘤標志物應用于人群初篩，濃聚高危人群，使內鏡篩查更具針對性，已成為迫切需要解決的問題。但迄今為止，在食管癌早期診斷方面，尚無特異性和敏感性均高的理想標志物可以應用。近期研究發現，食管癌的發生發展過程中許多蛋白分子的表達水平發生了改變，如p16、FHIT基因等［8］，但尚存在敏感性或特異性不高的缺點，不能滿足現場篩查的要求。本組用于構建3個蛋白指紋圖譜模型的質荷比峰4 291、4 392、4 823、4 975、5 644、5 665、5 932、8 473、8 776、8 910Da的表達量在組間比較差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），特別是質荷比峰4 291Da和5 644Da參與了2個模型的構建，可能是食管癌相關的候選腫瘤標志物。這些蛋白分子的協同變化可能是食管癌特異的腫瘤宿主微環境在血清蛋白組中的體現。對這些蛋白分子的鑒定和追蹤其在食管癌發展中的動態變化，可能為揭示該病發生規律提供有益線索。

本研究應用的支持向量機算法是基于統計學理論、依據結構風險最小化原則的一種學習算法，克服了其他信息學算法（如決策樹、人工神經網絡等）對大樣本的要求，尤其適用于小樣本研究，在醫療診斷中應用已獲得了很好的結果［9-10］。本研究應用SELDI-TOF-MS技術檢測到的海量數據，通過支持向量機方法建立蛋白指紋圖譜模型、篩選出潛在腫瘤標志物，研究結論較為準確、可靠，將進一步擴大樣本驗證和完善。

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（本文編輯：趙麗潔）

ESTABLISHMENT OF PROTEIN FINGERPRINT PATTERN FOR EARLY ESOPHAGEAL CANCER AND ITS SCREENING VALUE IN HIGH INCIDENCE AREA

YU Weifang1，NIU Weiwei1，LI Chao1，ZHANG Liwei2*，WANG Shijie2
（1.Department of Endoscopt，the First Hospital of Hebei Medical Universitt，Shijiazhuang 050031，China；
2.Department of Endoscopt，the Fourth Hospital of Hebei Medical Universitt，Shijiazhuang 050011，China）

ObjectiveTo bui1d protein fingerprint mode1s of ear1y esophagea1 cancer and advanced esophagea1 cancer in high incidence area，and investigate their screening va1ues.MethodsThe serum proteomic patterns of 38 cases of norma1 contro1s，15 cases of ear1y esophagea1 cancer and 36 cases of advanced esophagea1 cancer were detected by using surface enhanced 1aser desorption/ionization time of f1ight mass spectrometry（SELDI-TOF-MS）.A11 subjects were from endoscopic screening popu1ation in high-risk areas of esophagea1 cancer.The data was ana1yzed and the protein fingerprint mode1s were estab1ished by using support vector machine.The mode1s were va1idated by 1eave one cross va1idation.ResultsThe protein fingerprint mode1 cou1d differentiate ear1y esophagea1 cancer from norma1 contro1s with a specificity of 81.58% and a sensitivity of 80.00%.The mode1 cou1d differentiate advanced esophagea1 carcinoma from norma1 contro1s with a specificity of 89.47%and a sensitivity of 83.33%.The mode1 cou1d differentiate ear1y esophagea1 cancer from advanced esophagea1 cancer with a specificity of 73.33%and a sensitivity of 91.67%.The difference of protein expression peaks（4 291，4 392，4 823，4 975，5 644，5 665，5 932，8 473，8 776，8 910Da）was statistica11y significant between groups.ConclusionEstab1ishment of three protein fingerprint mode1s provides a new approach for diagnosingand screening ear1y esophagea1 cancer in high incidence area.The protein peaks which had statistica1 significance in diagnostic mode1s may be the potentia1 biomarkers re1ated to ear1y esophagea1 cancer.

esophagea1 neop1asms；peptide mapping；mass screening中國是食管癌高發國家，食管癌發病呈地域性分布，高低發區的發病率可相差幾十倍。河北省太行山脈南麓地區是我國的食管癌集中高發區［1］。目前，早發現、早診斷、早治療是公認高發區食管癌防治的最有效措施。但是食管癌早期發病隱匿，大多無吞咽癥狀，很難做到“早期診治”。因此，尋找簡便有效的篩查方法和敏感特異的腫瘤標志物應用于人群初篩，濃聚高危人群，已成為目前亟待解決的課題。本研究應用蛋白組學技術對高發區內鏡篩查出的早期和進展期食管癌及正常對照者的血清蛋白質譜進行對比分析，分別建立蛋白指紋圖譜模型，旨在篩選用于高發區早期食管癌篩查的候選腫瘤標志物。

R735.1

A

1007-3205（2012）04-0373-06

2012-02-13；

2012-04-11

河北省衛生廳青年基金課題（06130）

于衛芳（1973-），男，回族，河北承德人，河北醫科大學第一醫院副主任醫師，醫學碩士，從事消化道疾病內鏡診治研究。

*通訊作者。E-mai1：ydyynjzx@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.04.001