微波制備IFN-γ處理的小鼠H22肝癌瘤苗免疫荷瘤鼠的抗瘤作用

楊曉峰，楊新宏，朱艷菊，丁曉旭，盧冬梅，孫立新

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒外科，河北承德 067000）

微波制備IFN-γ處理的小鼠H22肝癌瘤苗免疫荷瘤鼠的抗瘤作用

楊曉峰，楊新宏*，朱艷菊，丁曉旭，盧冬梅，孫立新

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒外科，河北承德 067000）

目的探討用微波方法制備干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）處理的小鼠H22肝癌細(xì)胞瘤苗（microwave and IFN-γtreated H22 tumor cellsmaking H22 tumor vaccine，MITTV-H22）激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。方法小鼠皮下接種H22腫瘤細(xì)胞，同時于腫瘤接種部位皮下接種MITTV-H22進(jìn)行免疫治療。觀察2組小鼠的生存期，治療結(jié)束后取瘤稱質(zhì)量、測瘤體積、計算體積抑瘤率和質(zhì)量抑瘤率、觀察瘤組織病理切片。結(jié)果①實驗組小鼠的平均生存期為46.5d，對照組小鼠的平均生存期為34.0d（P＜0.05）。②實驗組小鼠的瘤塊體積增長速度明顯慢于對照組（F=179.318，P＜0.0）。③實驗組小鼠的平均瘤體積、平均瘤質(zhì)量小于對照組。④實驗組的體積抑瘤率為（57.80±18.40）%，質(zhì)量抑瘤率為（62.65±23.53）%。⑤實驗組腫瘤組織壞死明顯增多，大片壞死組織中可見散在成團(tuán)或島嶼狀的殘留瘤細(xì)胞，淋巴細(xì)胞多見，瘤體周邊纖維母細(xì)胞明顯增生。對照組腫瘤組織中瘤細(xì)胞增生活躍，局部可見小片狀壞死灶，腫瘤細(xì)胞間淋巴細(xì)胞極少見，瘤體周邊有很少或未見纖維母細(xì)胞增生。結(jié)論MITTV-H22對H22細(xì)胞型肝癌具有較強(qiáng)的治療作用。

肝腫瘤；癌癥疫苗；干擾素γ，重組；小鼠

目前腫瘤治療最具吸引力的生物學(xué)方法之一是腫瘤疫苗，由于腫瘤的抗原性較弱，難以激起機(jī)體足夠的抗腫瘤免疫反應(yīng)，且腫瘤細(xì)胞表達(dá)多種腫瘤抗原，針對某個或某些表位產(chǎn)生的免疫應(yīng)答不能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長，全細(xì)胞瘤苗可表達(dá)多種腫瘤抗原。根據(jù)干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗原遞呈能力，微波修復(fù)抗原提高病理切片的抗原性的原理，我們用IFN-γ處理H22腫瘤細(xì)胞，再用微波制備全細(xì)胞瘤苗，既消除了其致瘤性，又增強(qiáng)了其抗原性，且操作簡單。前期我們已經(jīng)做過用小鼠H22肝癌細(xì)胞瘤苗（microwave and IFN-γtreated H22 tumor cells making H22 tumor vaccine，MITTV-H22）對H22細(xì)胞型肝癌的預(yù)防作用，結(jié)果實驗組小鼠于H22腫瘤細(xì)胞攻擊后的7d左右接種部位沒有發(fā)現(xiàn)肉眼可見的包塊，經(jīng)解剖腫瘤接種部位未發(fā)現(xiàn)瘤組織。對照組于H22腫瘤細(xì)胞接種后第5或6天接種部位出現(xiàn)直徑＜0.5cm的包塊，成瘤率為100%，接種后7d平均瘤體積為（4.8±1.0）mm3。觀察120d，對照組小鼠平均生存期為（31.87±5.87）d，實驗組為（115.40±11.22）d，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因此我們想進(jìn)一步觀察MITTV-H22對H22細(xì)胞型肝癌的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物、細(xì)胞來源：健康的BALB/C小鼠60只，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量14～16g，8周齡，正常飼養(yǎng)。H22瘤株由白求恩醫(yī)科大學(xué)提供，液氮凍存。使用時由液氮中取出，37℃水浴融解后，RPMI-1640培養(yǎng)液洗3遍，接種于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細(xì)胞接種于BALB/C小鼠腹腔傳代。

1.2 MITTV-H22的制備：收集BALB/C小鼠腹水H22腫瘤細(xì)胞，1640培養(yǎng)液洗2遍，用H22腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，加入IFN-γ（200U/mL），37℃、5%CO2共培養(yǎng)48h［1］。收集H22腫瘤細(xì)胞，生理鹽水洗2遍，制成2.5×106/mL的H22細(xì)胞懸液，微波照射20s（750W、2 450MHz），經(jīng)臺盼藍(lán)染色后光鏡下觀察證實H22腫瘤細(xì)胞已被全部滅活，制成MITTV-H22，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗分組與動物模型的制備：60只小鼠檢疫10d后隨機(jī)分成2組，實驗組（A、C、E）與對照組（B、D、F），每組各30只，每個亞組各10只。每組小鼠右腋皮下接種H22腫瘤細(xì)胞（1×106個），同時實驗組于腫瘤接種部位皮下接種MITTV-H22（2.5× 106/mL）0.2mL進(jìn)行免疫治療，每隔2天免疫1次，共6次，對照組用生理鹽水代替MITTV-H22進(jìn)行治療對照。A、B 2組用于觀察小鼠的生存期。C、D 2組于腫瘤接種后的第6天開始用游標(biāo)卡尺測量瘤體積，每隔2天1次，共6次，畫腫瘤生長曲線。E、F 2組治療6次后，取瘤塊稱質(zhì)量、測體積、觀察病理切片。

1.4 實驗指標(biāo)的檢測

1.4.1 瘤體積觀察：2組于腫瘤接種后的第6天開始用游標(biāo)卡尺測量瘤體積，每隔2天1次，共6次。MITTV-H22治療6次后，取2組的瘤塊，測量瘤體積、電子天平稱質(zhì)量。瘤塊體積的計算公式為，V= 0.4×a×b2（a為瘤塊長軸，b為瘤塊短軸）。質(zhì)量抑瘤率=（對照組平均瘤塊質(zhì)量-實驗組平均瘤塊質(zhì)量）/對照組平均瘤塊質(zhì)量。體積抑瘤率=（對照組平均瘤塊體積-實驗組平均瘤塊體積）/對照組平均瘤塊體積。

1.4.2 瘤體病理切片觀察：MITTV-H22治療6次后，取實驗組與對照組的瘤塊，用流水洗去組織表面的黏液及血液，然后投入有足量10%甲醛的容器中，固定時間不少于24h，進(jìn)行HE染色。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，分別采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析和t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

實驗組小鼠的平均生存期為46.5d，對照組小鼠的平均生存期為34.0d（t=6.96，P＜0.05）。實驗組不同時點小鼠的瘤塊體積明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=179.32，P＜0.05）。見表1。

表1 實驗組與對照組腫瘤體積的變化

實驗組小鼠的平均瘤體積為（0.67±0.21）cm3，小于對照組的（1.84±0.74）cm3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.78，P＜0.05）。實驗組小鼠的平均瘤質(zhì)量為（0.67±0.35）g，低于對照組的（1.91±0.34）g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.96，P＜0.05）。實驗組的體積抑瘤率為（57.80±18.40）%，質(zhì)量抑瘤率為（62.65±23.53）%。

HE染色瘤體病理學(xué)觀察，實驗組腫瘤組織壞死明顯增多，大片壞死組織中可見散在成團(tuán)或島嶼狀的殘留瘤細(xì)胞，淋巴細(xì)胞多見，瘤體周邊纖維母細(xì)胞明顯增生。對照組腫瘤組織中瘤細(xì)胞增生活躍，局部可見小片狀壞死灶，腫瘤細(xì)胞間淋巴細(xì)胞極少見，瘤體周邊有很少或未見纖維母細(xì)胞增生（圖1～ 6）。

3 討 論

目前，腫瘤疫苗是腫瘤治療最具吸引力的生物學(xué)方法，但腫瘤疫苗最大的潛在問題是腫瘤抗原的免疫原性弱，機(jī)體免疫系統(tǒng)不能識別腫瘤細(xì)胞，從而無法徹底殺滅腫瘤。因此，提高腫瘤疫苗抗原的表達(dá)是提高宿主對腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)的關(guān)鍵。

絕大多數(shù)強(qiáng)免疫原性腫瘤引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，T細(xì)胞分泌腫瘤特異性IFN-γ，腫瘤溶解壞死；而弱免疫原性或所謂的非免疫原性腫瘤則無抗瘤效應(yīng)，腫瘤繼續(xù)生長。主動特異性免疫（自體疫苗）治療的策略就是使弱免疫原性腫瘤通過佐劑等手段予以修飾，增強(qiáng)其免疫原性，由免疫無效轉(zhuǎn)化為抗瘤反應(yīng)［2］。

研究［3］發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腫瘤表面抗原減弱、細(xì)胞表面主要組織相容性抗原（major histocompatibilty complex classⅠ，MHC-Ⅰ）類分子的表達(dá)下調(diào)或丟失，導(dǎo)致免疫細(xì)胞的應(yīng)答無能是腫瘤細(xì)胞普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象，也是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視，逃逸特異性CTL抗腫瘤免疫應(yīng)答的重要機(jī)制。IFN-γ是調(diào)節(jié)MHC-Ⅰ類抗原高表達(dá)的一個重要生物因子［4-6］，能直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，增加表面MHC抗原和腫瘤壞死因子的表達(dá)、抗腫瘤血管生成等［7］。

腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫攻擊的另一原因是腫瘤細(xì)胞表面“抗原覆蓋”或被封閉，因而腫瘤抗原不能被宿主的淋巴細(xì)胞所識別，不能有效地被殺傷。微波作為抗原修復(fù)的方法已廣泛應(yīng)用于免疫組織化學(xué)染色的抗原暴露，是最敏感的抗原修復(fù)方法［8-9］。它可以使病理切片的抗原更充分暴露，提高免疫組織化學(xué)染色的敏感性。用微波處理惡性腫瘤細(xì)胞，制成瘤苗免疫小鼠，將有助于增強(qiáng)小鼠的抗腫瘤免疫，抑制腫瘤生長。

本研究中實驗組小鼠的生存期高于對照組，實驗組小鼠的瘤質(zhì)量和瘤體積均小于對照組。瘤體組織學(xué)觀察，實驗組小鼠皮下腫瘤組織大面積壞死，腫瘤周邊有較豐富的纖維母細(xì)胞及較多的淋巴細(xì)胞浸潤；而對照組小鼠的瘤組織有灶狀壞死，腫瘤周邊沒有或有很少纖維母細(xì)胞，淋巴細(xì)胞浸潤也少見。推測腫瘤大面積壞死和體積、質(zhì)量小可能與腫瘤組織中大量淋巴細(xì)胞的浸潤和纖維母細(xì)胞增生有關(guān)。進(jìn)一步推測MITTV-H22免疫可能促進(jìn)淋巴細(xì)胞浸潤和纖維母細(xì)胞的增生。（本文圖見封二）

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（本文編輯：劉斯靜）

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R735.7

B

1007-3205（2012）07-0808-03

2011-11-30；

2012-02-01

楊曉峰（1975-），男，滿族，河北灤平人，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事小兒外科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：caccine.tumor@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.07.023