蛋氨酸對化療藥物引起內耳損傷的保護作用

黃 瑛，馬穎鈺，張 璞，林 曦，曲 雁*

（1.云南省昆明市第一人民醫院耳鼻咽喉科，云南昆明 650000；2.河北醫科大學第三醫院耳鼻咽喉科，河北石家莊 050051；3.美國Emory大學醫學院耳鼻咽喉頭頸外科，喬治亞州亞特蘭大 30322-3030）

蛋氨酸對化療藥物引起內耳損傷的保護作用

黃 瑛1，馬穎鈺2，張 璞2，林 曦3，曲 雁2*

（1.云南省昆明市第一人民醫院耳鼻咽喉科，云南昆明 650000；2.河北醫科大學第三醫院耳鼻咽喉科，河北石家莊 050051；3.美國Emory大學醫學院耳鼻咽喉頭頸外科，喬治亞州亞特蘭大 30322-3030）

目的研究蛋氨酸對化療藥物順鉑導致耳毒性的保護作用。方法將30只昆明小鼠隨機分為3組。順鉑組（n=10）：給予順鉑3.5mg·kg-1·d-1腹腔注射，連續7d；蛋氨酸+順鉑組（n=10）：蛋氨酸300mg·kg-1· d-1腹腔注射，30min后給予順鉑3.5mg·kg-1·d-1腹腔注射，連續7d；對照組（n=10）：生理鹽水3.5mg·kg-1· d-1腹腔注射，連續7d。實驗第8天，利用聽覺腦干誘發電位（auditory brainstem response，ABR）對3組小鼠進行聽功能測試，然后迅速斷頭取出雙側內耳，解剖耳蝸基底膜，鋪片并HE染色，普通光學顯微鏡下觀察。結果在ABR測試中，對照組小鼠實驗前后聽力無明顯變化；順鉑組小鼠聽閾及Ⅰ波和Ⅲ波潛伏期與對照組相比變化明顯；蛋氨酸+順鉑組小鼠聽閾及Ⅰ波和Ⅲ波潛伏期與對照組相比也出現變化，但變化程度較順鉑組明顯減輕。光鏡觀察：對照組動物耳蝸基底膜外毛細胞排列整齊；順鉑組基底膜外毛細胞有不同程度的壞死、脫落，尤以底轉缺失嚴重；蛋氨酸+順鉑組耳蝸毛細胞損傷較順鉑組明顯減輕。結論化療藥物順鉑對耳蝸毛細胞引起損害，而蛋氨酸對這種損害有較好的保護作用。

內耳；S-腺苷甲硫氨酸；順鉑

1 材料與方法

1.1 實驗動物：選取30只昆明小鼠，體質量15～30g，耳廓反應靈敏，雌雄均有，小鼠專用鼠糧喂養。將其隨機分為3組，每組10只（n=10）。順鉑組，給予順鉑3.5mg·kg-1·d-1腹腔注射，連續7d；蛋氨酸+順鉑組，首先蛋氨酸300mg·kg-1·d-1腹腔注射，30min后給予順鉑3.5mg·kg-1·d-1腹腔注射，連續7d；對照組，生理鹽水3.5mg·kg-1·d-1腹腔注射，連續7d。

1.2 腦干誘發電位（auditory brainstem response，ABR）的檢測：小鼠在腹腔注射水合氯醛（400mg/ kg）麻醉后，采用美國Nico-let公司questTM型誘發電位檢測儀對用藥后的小鼠聽功能進行測試。以波Ⅲ閾值作為判斷ABR閾值的標準［2］，并測量100dB peSPL時的Ⅰ波和Ⅲ波的潛伏期。

1.3 光鏡標本制作及觀察：測試ABR后，在小鼠麻醉狀態下立即斷頭并取出雙側聽泡，在解剖顯微鏡下解剖耳蝸，蝸尖鉆孔，從蝸尖灌注10%福爾馬林溶液并在4℃下在此溶液當中固定24h。固定的耳蝸經0.1mol/L的PBS液沖洗后用10%乙二胺四乙酸二鈉脫鈣1周，每天更換脫鈣液1次，而后經0.1mol/L的PBS液洗滌3次后，在解剖顯微鏡下進行耳蝸基底膜的剝離，將基底膜進行分回截斷鋪片并HE染色，普通光學顯微鏡（放大400倍）下觀察［3］。

1.4 統計學方法：應用SASV8.0統計軟件進行數據處理，計量資料以±s表示，分別采用F檢驗和q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ABR反應閾和ABR的Ⅰ波和Ⅲ波潛伏期：3組小鼠之間聽力出現明顯變化，順鉑組小鼠Ⅲ波閾值明顯增加且Ⅰ波和Ⅲ波潛伏期明顯延長，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。蛋氨酸+順鉑組小鼠Ⅲ波閾值及Ⅰ波和Ⅲ波潛伏期也出現增加和延長，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），且與順鉑組小鼠比較差異也有統計學意義（P＜0.05），即蛋氨酸+順鉑組小鼠聽力的變化較順鉑組小鼠的變化小。見表1。

表1 順鉑組、蛋氨酸+順鉑組和對照組ABR水平比較Table 1 The result of ABR of cisp latin group，methionine group and control group

2.2 光鏡觀察：對照組小鼠耳蝸基底膜外毛細胞排列整齊，結構清晰，無變性、損壞。順鉑組小鼠基底膜外毛細胞有不同程度的壞死、脫落，尤以底轉缺失嚴重。蛋氨酸+順鉑組小鼠耳蝸毛細胞較順鉑組小鼠耳蝸毛細胞損傷明顯減輕，尤以底轉和中轉的保護作用明顯。見圖1～3。

圖1 耳蝸基底膜底轉毛細胞情況（HE×400） A.對照組底轉，外毛細胞排列整齊、結構清晰；B.蛋氨酸+順鉑組底轉，外毛細胞有間斷的缺失；C.順鉑組底轉，外毛細胞缺失嚴重Figure1 Thehaircellsofbaselturninthecocheal（HE×400） A.Onbasalturn，outercellsofcontrolgroupshowinglinedupregularlyandclear；B.Onbasalturn，outer cellsofD-metgrouplosinginterruptablely；C.Onbasalturn，outercellsofcisplatingroup losingextensively圖2 耳蝸基底膜中轉毛細胞情況（HE×400） A.對照組中轉，外毛細胞排列整齊、結構清晰；B.蛋氨酸+順鉑組中轉，外毛細胞有間斷的缺失；C.順鉑組中轉，外毛細胞缺失嚴重Figure2 Thehaircellsofmiddleturninthecocheal（HE×400） A.Onmiddleturn，outercellsofcontrolgrouparelinedupregularly；B.Onmiddle turn，outercellsofD-metgrouplosinginterruptablely；C.Onmiddleturn，outercellsofcisplatingrouplosingextensively圖3 耳蝸基底膜頂轉毛細胞情況（HE×400） A.對照組頂轉，外毛細胞排列整齊、結構清晰；B.蛋氨酸+順鉑組頂轉，外毛細胞有間斷的缺失；C.順鉑組頂轉，外毛細胞缺失嚴重Figure3 Thehaircellsofapicalturninthecocheal（HE×400） A.Onapicalturn，outercellsofcontrolgroupshowinglinedupregularly；B.Onapical turn，outercellsofD-metgrouplosinginterruptablely；C.Onapicalturn，outercellsofcisplatingrouplosingextensively

3 討 論

順鉑引起的耳毒性在臨床上表現為耳鳴、耳聾，聽力損失的特點呈進行性、不可逆性和雙側性并伴隨聽覺器官的永久性損害。順鉑處理過的動物聽力腦干反應閾值增加，特別是高頻。有研究［3］表明，順鉑引起的動物毛細胞損害總是首先從耳蝸底回開始并逐漸向頂回發展，因此聽力功能障礙往往首先表現為高頻聽力的損失。這與本研究觀察到的結果是一致的，而隨著毛細胞損害范圍的擴大，低頻聽力也隨之發生障礙。

順鉑引起的毒性機制目前有多種假說，其中自由基引起的氧化應激是順鉑引起耳毒性的重要機制之一［4］。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一類性質活潑的自由基，其攻擊的靶點是膜脂的多不飽和脂肪酸，從而使細胞膜的結構和功能發生改變。有研究［5］表明，在耳蝸分離組織中應用順鉑會產生大量ROS，使耳蝸內的抗氧化劑谷胱甘肽及抗氧化酶減少，還會引起脂質過氧化，脂質過氧化可使細胞鈣離子內流，細胞的凋亡增加。可見，應用順鉑后打破了細胞內自由基的平衡，大量產生的ROS通過一系列的反應導致毛細胞的死亡，最終引起聽力的損失。但是在機體內，自由基的產生與清除處于動態平衡當中，抗氧化劑能消除自由基，維持正常的細胞結構和功能。耳蝸的內源性防護分子包括谷胱甘肽、抗氧化物酶、熱休克蛋白、腺苷受體以及血紅素加氧酶等［6］，雖然這些分子在應用順鉑后會有一定的表達上調，但是順鉑的大劑量應用所引起的氧化應激可以壓倒這些內在的防御機制，從而不能完全克服順鉑的毒性作用。

抗氧化劑作為外源性保護分子可以拮抗ROS引起的損傷。蛋氨酸作為一種巰基抗氧化劑具有多種保護作用但最主要的是直接或間接的抗氧化劑，大多數巰基化合物都是親電子的，可以清除自由基。Vogt等［7］研究證明蛋氨酸可以使氧化可逆，充當了一種自由基清除劑。蛋氨酸表現出多樣的抗氧化作用是通過對主要酶類的保護而實現的。蛋氨酸可以明顯防止順鉑引起的耳蝸超氧化物歧化酶、過氧化氫酶以及谷胱甘肽還原酶的水平的降低，防止谷胱甘肽過氧化物酶和丙二醛水平的上升［8］。大量的蛋氨酸可以阻止谷胱甘肽從細胞內流出從而保護細胞免受損傷。在預防耳毒性上，蛋氨酸可以對噪聲及氨基糖甙類抗生素引起的聽力損失起保護作用，蛋氨酸對慶大霉素導致的聽力損傷的防治作用是通過抑制產生的ROS和一氧化氮實現保護耳蝸的感覺細胞的，鑒于藥物耳毒性有著相類似的發病機制，本研究將蛋氨酸用于順鉑耳毒性的預防上，在形態上蛋氨酸在底轉、中轉和頂轉對順鉑引起的毛細胞損害有著很好的保護作用；在功能上，通過聽性腦干反應的檢測可以發現，蛋氨酸可以使ABR閾值降低。ABR波Ⅰ來自耳蝸（常受耳蝸基底回病變特征的影響），波Ⅱ來自耳蝸核，波Ⅲ來自上橄欖核，波Ⅳ來自外側丘系，波Ⅴ來自下丘。藥物性耳毒性引起的聽力損傷部位常涉及到耳蝸基底回。順鉑+蛋氨酸組測量的Ⅰ波的潛伏期縮短，很好地證明了蛋氨酸在耳蝸基底回對順鉑引起的聽力損失具有保護作用。

總之，巰基化合物蛋氨酸可以在形態和功能上對順鉑造成的耳蝸損害有一定的保護作用。另外，有報道稱蛋氨酸在防御耳蝸毒性的同時卻不影響抗腫瘤藥的效果［9］，且口服與腹腔注射相同量的蛋氨酸在ABR的功能測定上有等同的作用［10］。因此，我們認為蛋氨酸將有望成為一類有前途的防御耳毒性的藥物，為廣大順鉑應用者提供了保護聽力的極大可能。

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（本文編輯：趙麗潔）

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THE PROTECTIVE EFFECT OF METH IONINE AGAINST COCHLEAR DAM AGE INDUCED BY CHEMOTHERAPEUTICS

HUANG Ying1，MA Yingyu2，ZHANG Pu2，LIN Xi3，QU Yan2*
（1.Department of Otorhinolaryngology，the First Hospital of Kunming City，Yunnan Province，Kunming 650000，China；2.Department of Otorhinolaryngology，the Third Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050051，China；
3.Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，School of Medicine，Emory University，Atlanta，GA 30322-3030，USA）

ObjectiveTo evaluate the protective effect of methionine against the ototoxicity induced by cisplatin.MethodsThirty Kunming mice were divided into three groups.Themice of group one intraperitoneallywere injected with cisplatin（3.5mg·kg-1·d-1）alone；themice of group two were injected methionine（300mg·kg-1·d-1）30 min before receiving cisplatin；and themice of group three received saline injection only in equal volume to the cisplatin group.All of the injection were given once daily for 7 consecutive days.Auditory brainstem response（ABR）audiometry was used to evaluate the hearing level.Then，themicewere sacrificed and acoustic capsulewere removed.The basalmembranewas obtained，and stained with HE.It was observed under the lightmicroscope.ResultsAuditory threshold shifts：there was no obvious change after the experiment in the control group，the ABR thresholds and the peak latency of waveⅠand waveⅢwere changed dramatically in injected cisplatin alone group compared with the control group，and the change was also appeared in injected methionine group，but itwas not so great.Morphology，outer hair cells from basilarmembrane in the control group were lined up regularly.Extensive loss of outer hair cells could be seen in basal turns of cochlear treated with cisplatin. Moderate hair cell losswas seen in themiddle turns of these ears.In contrast，basilarmembrane waswell preserved in all turns of the cochlea in themethionine group，especially in basal turn and in middle turn.ConclusionCisplatin can induce ototoxicity to the organ of Corti，and the protective effect ofmethionine against this ototoxicity can be seen in both function and morphology.

ear，inner；s-adenosylmethionine；cisplatin順鉑是一種臨床中常用的化療藥物，其對睪丸精原細胞瘤、卵巢腫瘤晚期等生殖系統腫瘤的治療以及腫瘤的聯合化療具有無可替代的優勢，但是順鉑引起的耳毒性、腎毒性及神經毒性等不良反應阻礙了其在臨床中的應用。順鉑引起的毒性機制目前還不十分清楚，但有研究發現順鉑可以損傷耳蝸的螺旋器和螺旋神經節細胞［1］。如何對抗順鉑應用過程中的耳毒性損傷，一直是人們研究的熱點。蛋氨酸又名甲硫氨酸，其不但是一種必需氨基酸參與蛋白質的合成，還可利用所帶的甲基對有毒物或藥物進行甲基化而起到解毒的作用，另外，蛋氨酸可以充當含硫抗氧化劑。本研究通過動物實驗，從形態和功能上探討蛋氨酸對順鉑導致的耳毒性損傷的對抗作用。

R764.83

A

1007-3205（2012）08-0904-04

2012-01-26；

2012-04-24

河北省自然科學基金資助項目（C2010000586）

黃瑛（1963-），女，湖南長沙人，云南省昆明市第一人民醫院耳鼻咽喉科副主任醫師，從事耳鼻咽喉科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：quyan_2003@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.08.013