阿魏酸雙芐酯的合成及生物活性研究

孟繁龍，李 碩，張慶一，張宇超，楊云彩，孫學軍

(曲阜師范大學化學與化工學院 山東省生命有機分析重點實驗室，山東 曲阜 273165)

阿魏酸，化學名為4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸，是植物界普遍存在的一種酚酸，也是當歸、川芎、阿魏等中藥的有效成分之一[1]，作為國際公認的天然抗氧化劑和防癌物質引起世人關注[2]。研究發現，阿魏酸具有抗動脈粥樣硬化、抗血小板凝集和血栓、清除亞硝酸鹽和氧自由基、抗菌消炎、抗腫瘤、抗突變和增強免疫力等功能[3]。目前，一些國家已批準阿魏酸用于食品、化妝品及藥品[4]。

阿魏酸分子中的烷烴較短且含有雙鍵，親水性較強，難以深入生物膜脂質雙分子層中發揮其藥理作用[5]。研究表明，阿魏酸衍生物比阿魏酸具有更強的藥理活性和較低的毒性[6]。目前，已成功合成了阿魏酸酯類衍生物、阿魏酸酰胺類衍生物、阿魏酸醚類衍生物、阿魏酸酮類衍生物、芳環有取代基的阿魏酸衍生物[5]，其中以阿魏酸鈉鹽、阿魏酸哌嗪、阿魏酸的高分子載體衍生物等為代表的部分化合物已經用于臨床或具有臨床應用的潛力[7]。然而，有關阿魏酸雙芐酯的合成、抑菌活性及與DNA相互作用的研究報道仍不多見[8～15]。

作者在此以二甲基亞砜(DMSO)為溶劑，以阿魏酸與氯化芐在堿性條件下反應，成功合成了阿魏酸雙芐酯，對其結構進行了表征，并研究了其生物活性。擬為進一步研究阿魏酸雙芐酯及其水解產物的抑菌活性和抗癌作用提供參考。反應方程式為：

1 實驗

1.1 試劑、材料與儀器

阿魏酸(純度>98.5%)，曲阜弘利化工有限公司；大腸桿菌，山東省衛生防疫站；小牛胸腺DNA(ct-DNA，A260/A280>1.8，未做提純處理)、吖啶橙(Acridine orange，AO)，Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris，分析純)，上海展云化工有限公司；其它試劑均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

牛肉浸膏液體培養基：取200 mL水、2 g蛋白胨、1 g牛肉浸膏、1 g氯化鈉，加熱煮沸，冷卻至室溫后，調pH值至7.2～7.4，121 ℃蒸汽滅菌30 min，冷卻至室溫后，置于冰箱中備用。

WRS-1A型數字熔點儀，上海精賢光電科技有限公司；655A型高效液相色譜儀、F-4600型熒光分光光度計，日本日立；CARY300型紫外可見分光光度計，美國瓦里安；NEXUS-470型傅立葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet；AVANCE 300型核磁共振儀，德國Bruker公司；7.0T型傅立葉變換離子回旋共振質譜儀，美國IonSpec；SMART APEX CCD型X-射線單晶衍射儀，美國Bruker AXS Inc；3114/3236 TAM Air型八通道微量熱活性檢測儀，瑞典Thermal Metric AB公司；烏貝路德粘度計，上海化學試劑公司。

1.2 阿魏酸雙芐酯的合成

將0.01 mol阿魏酸、0.025 mol NaHCO3和15 mL DMSO加入到帶有攪拌的三頸燒瓶中，加熱溶解后滴入0.022 mol氯化芐和5 mL DMSO的混合溶液，控溫110～120 ℃,控制pH=8～9，反應1.5 h，用TLC檢測反應進程[展開劑為V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶3的混合溶液]。反應完成后稍加冷卻，倒入100 mL冰水中，即有白色固體析出。靜置，抽濾，濾餅用25 mL無水乙醇重結晶，得到白色針狀晶體，即阿魏酸雙芐酯，產率為94.32%。

1.3 大腸桿菌抑菌活性實驗

用微量量熱法測定不同濃度的阿魏酸雙芐酯溶液對大腸桿菌代謝作用的熱功率-時間曲線。

(1)用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)準確配制濃度為0.25 mg·mL-1的阿魏酸雙芐酯溶液，置于冰箱中備用。

(2)在紫外燈下，用酒精燈灼燒過的取菌器轉移大腸桿菌到牛肉浸膏液體培養基中，反復3次，在恒溫下密封培養。

(3)將安瓶放在滅菌臺上消毒15 min，然后裝入培養基并接菌，移入一定量的阿魏酸雙芐酯溶液，封口，放入基線穩定且溫度恒定在37 ℃的微量熱活性檢測儀中，開始記錄數據，當細菌代謝的熱功率—時間曲線返回到基線時即可認為實驗結束。

1.4 與DNA相互作用的研究

1.4.1 試劑的配制

ct-DNA：配成濃度為2.3×10-4mol·L-1的水溶液，其濃度據260 nm處的吸光度確定(按ε=6600 L·mol-1·cm-1)，置于冰箱中備用。

吖啶橙：配成濃度為1×10-4mol·L-1的水溶液，置于冰箱中備用。

三羥甲基氨基甲烷：用其配制Tris-HCl(pH=7.4)緩沖溶液，內含0.1 mol·L-1NaCl。

阿魏酸雙芐酯：用無水乙醇配成濃度(用[D]表示)為1×10-3mol·L-1的溶液，避光保存。

1.4.2 與DNA相互作用的紫外光譜測定

在1 cm比色皿中加入2 mL Tris-HCl緩沖溶液、0.2 mL阿魏酸雙芐酯溶液，搖勻，用ct-DNA溶液進行滴定，掃描紫外吸收光譜，每次進樣50 μL。

1.4.3 與DNA相互作用的熒光光譜測定

在1 cm比色皿中加入2 mL Tris-HCl緩沖溶液、0.1 mL吖啶橙溶液、0.3 mL ct-DNA溶液，搖勻，放置5 min，用阿魏酸雙芐酯溶液滴定，掃描熒光光譜，每次進樣20 μL。熒光條件為：激發和發射狹縫均為5 nm，λex=480 nm，電壓700 V，掃描速率1200 nm·s-1。

1.4.4 粘度測定

固定ct-DNA濃度，改變阿魏酸雙芐酯濃度，以Tris-HCl緩沖溶液配制溶液，在25 ℃恒溫水浴槽中用烏氏粘度計測定其粘度。

2 結果與討論

2.1 產品表征

產品為白色針狀晶體，熔點為86～87 ℃，高效液相色譜儀測得純度為98.5%。

紫外可見分光光度計測得最大吸收波長為204 nm、236 nm、325 nm。

IR(KBr)，ν：3133 cm-1處為苯環C-H伸縮振動特征吸收峰，1510 cm-1處為苯環骨架伸縮振動特征吸收峰，1696 cm-1處為羰基伸縮振動特征吸收峰，1400 cm-1處為CH2中C-H變形振動特征吸收峰，1247 cm-1處為芳醚中C-O-C伸縮振動特征吸收峰，999 cm-1處為E型碳碳雙鍵中C-H變形振動特征吸收峰。

1HNMR(CDCl3)，δ，ppm：3.90(s，3H，CH3)，5.18(s，2H，CH2)，5.24(s，2H，CH2)，6.35(m，1H，C=CH)，6.86(m，1H，C=CH)，7.01～7.68(m，13H，3C6H6)。

質譜儀測得其相對分子質量為374.4291 g·mol-1。

X-射線單晶衍射儀測得其分子結構見圖1。

圖1 阿魏酸雙芐酯的分子結構

綜合分析，確定合成產物為阿魏酸雙芐酯。

2.2 對大腸桿菌的抑菌活性

根據大腸桿菌在一定濃度的阿魏酸雙芐酯溶液中代謝作用的熱功率-時間曲線數據，用Logistic方程處理細菌的指數生長期，計算出該濃度下的細菌生長速率常數μ[16]。大腸桿菌在不同濃度的阿魏酸雙芐酯溶液中的生長速率常數見表1。

表1 大腸桿菌在不同濃度的阿魏酸雙芐酯溶液中的生長速率常數

以生長速率常數μ對濃度c作圖，所得μ-c曲線見圖2。擬合線性回歸方程為：μ=0.08793-0.00295c。

圖2 阿魏酸雙芐酯對大腸桿菌抑菌活性的μ-c曲線

μ=0 min-1時所對應的c值，即為阿魏酸雙芐酯對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)。

測得37 ℃下阿魏酸雙芐酯對大腸桿菌的最小抑菌濃度為29.81 μg·mL-1，說明阿魏酸雙芐酯對大腸桿菌具有一定的抑制作用。

王利萍[11]研究表明，以阿魏酸乙酯為代表的阿魏酸鏈狀酯對大腸桿菌沒有抑菌活性；梁盛年等[12]、張春樂等[13]研究表明，只有肉桂酸和少數肉桂酸衍生物對大腸桿菌有抑制作用，例如：肉桂酸和對羥基肉桂酸對大腸桿菌有一定的抑菌活性，其MIC值分別為1 mg·mL-1和0.75 mg·mL-1。該值遠大于阿魏酸雙芐酯對大腸桿菌的最小抑菌濃度，說明后者對大腸桿菌有更好的抑制作用。這為進一步研究阿魏酸雙芐酯及其水解產物的抑菌活性提供了參考。

2.3 與DNA的相互作用

2.3.1 紫外光譜分析

在pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，阿魏酸雙芐酯與ct-DNA系列溶液的紫外吸收光譜見圖3。

[D]=1×10-3 mol·L-1；[ct-DNA]=2.3×10-4 mol·L-1；ct-DNA用量(μL)，1～13：0，50，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600

由圖3可以看出，ct-DNA使阿魏酸雙芐酯原本在236 nm、325 nm兩處的最大吸收波長發生了紅移，對前者的吸收具有明顯的增色效應，對后者的吸收具有一定的減色效應，并且在295 nm附近形成一個等色吸收點，這說明阿魏酸雙芐酯與ct-DNA發生了相互作用。Long等認為，當小分子與DNA發生嵌插作用時，小分子的π軌道和DNA堿基π軌道相互耦合，最大吸收峰發生紅移或藍移，且存在減色或增色效應；當小分子與DNA發生靜電作用時，峰位置不變，只有強度改變[15]。據此初步判斷阿魏酸雙芐酯是以經典插入方式與ct-DNA鍵合的。

2.3.2 熒光光譜分析

吖啶橙(AO) 可以插入到DNA雙鏈的堿基對之間，因此AO-DNA復合物中AO的熒光強度比游離AO的熒光強度強得多。然而當其它也能與DNA發生插入作用的化合物存在時，會將AO從AO-DNA復合物中擠出，使得熒光強度降低發生熒光猝滅，因此AO可作為化合物與DNA作用模式的結構探針[17]。

固定AO、ct-DNA濃度，考察阿魏酸雙芐酯濃度對AO-DNA體系熒光光譜的影響，結果如圖4所示。

[ct-DNA]=2.3×10-4mol·L-1；[AO]=1×10-4mol·L-1；[D]=1×10-3mol·L-1；阿魏酸雙芐酯用量(μL)，1～11：0，20，40，60，80，100，120，140，160，180，200

由圖4可以看出，AO-DNA熒光特征峰的強度隨阿魏酸雙芐酯用量(即濃度)的增加而下降，說明阿魏酸雙芐酯對AO-DNA的熒光具有猝滅作用。這可能是阿魏酸雙芐酯同AO競爭與DNA的結合位點，將AO從雙螺旋中擠出，從而減弱了AO-DNA體系的熒光強度。

熒光猝滅作用因猝滅機制不同分為動態猝滅和靜態猝滅。動態猝滅是猝滅劑和熒光物質的激發態分子之間的相互作用，其作用過程遵循Stern-Volmer方程[18]：

F0/F=1+Kqτ0[D]=1+KSV[D]

式中：F0和F為未加入和加入阿魏酸雙芐酯時熒光物質的熒光強度；Kq為雙分子猝滅過程的速率常數；τ0為沒有阿魏酸雙芐酯存在下熒光分子的平均壽命，約10-8s；KSV為Stern-Volmer猝滅常數。

以阿魏酸雙芐酯最大發射波長525 nm處的熒光強度按Stern-Volmer方程作線性回歸，得到阿魏酸雙芐酯對ct-DNA的Stern-Volmer猝滅常數KSV為3.26×103L·mol-1，進一步求得其雙分子猝滅過程的速率常數Kq為3.26×1011L·mol-1·s-1，遠大于猝滅劑對生物大分子最大擴散控制的碰撞猝滅常數2.0×1010L·mol-1·s-1，由此確定阿魏酸雙芐酯對ct-DNA的猝滅并非分子間動態碰撞所致，而是由于形成復合物所引起的靜態猝滅。

靜態猝滅可用Lineweaver-Burk雙倒數方程進行描述[19]，即：

式中：KD為阿魏酸雙芐酯與ct-DNA的結合常數。

圖5 阿魏酸雙芐酯對AO-DNA體系作用的Lineweaver-Burk雙倒數曲線

由圖5中直線的斜率求得阿魏酸雙芐酯與ct-DNA的結合常數KD=1.58×103L·mol-1。

2.3.3 粘度測定分析

在缺乏晶體數據的情況下，粘度測定被認為是確定鍵合模式最可靠的方法之一。配合物以部分插入的方式與DNA結合時，DNA溶液的粘度隨配合物含量的增加而減小；以靜電或溝面方式結合時，DNA溶液的粘度變化不大；而通過經典插入方式與DNA作用時，DNA溶液的粘度隨配合物含量的增加而增大[20]。

25 ℃下，阿魏酸雙芐酯用量對ct-DNA相對比粘度的影響見圖6。

圖6 阿魏酸雙芐酯用量對ct-DNA相對比粘度的影響

由圖6可以看出，隨著ct-DNA中阿魏酸雙芐酯濃度的增大，其相對比粘度逐漸增大，由此可進一步判斷阿魏酸雙芐酯與DNA的作用方式為經典插入方式。

項朋志等[14]用電化學方法研究發現，阿魏酸與DNA的相互作用以嵌插作用為主，結合常數為1.01×104L·mol-1。于婷婷等[15]用紫外光譜法研究發現，阿魏酸乙酯與DNA結合生成了一種非電活性的超分子化合物，結合常數為6.0×106L·mol-1。而本研究發現阿魏酸雙芐酯與ct-DNA的作用方式為經典插入方式，結合常數為1.58×103L·mol-1。由此表明，阿魏酸及其不同衍生物與DNA的作用方式和結合強度差別較大。

3 結論

以DMSO為溶劑，以阿魏酸與氯化芐在堿性條件下反應合成了阿魏酸雙芐酯，產率為94.32%，純度為98.5%。通過紫外光譜、紅外光譜、核磁共振氫譜、質譜及X-單晶衍射對產物結構進行了表征。用微量量熱法測得阿魏酸雙芐酯對大腸桿菌的MIC值為29.81 μg·mL-1，說明阿魏酸雙芐酯對大腸桿菌具有一定的抑制作用。通過紫外光譜、熒光光譜和粘度測定證實阿魏酸雙芐酯與ct-DNA之間存在相互作用，其作用方式為經典插入方式，對ct-DNA的猝滅是由于形成復合物所引起的靜態猝滅，與ct-DNA的結合常數為1.58×103L·mol-1。為進一步研究阿魏酸雙芐酯及其水解產物的抑菌活性和抗癌作用提供了具有參考價值的信息。

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