卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺的測定

張鳳梅，楊 柳，孟昭宇，吳億勤，伊奧爾，牟定榮

(紅塔煙草(集團)有限責任公司技術中心，云南 玉溪 653100)

煙草特有亞硝胺(TSNAs)是煙草中N-亞硝胺含量最豐富的一類亞硝胺物質，只存在于煙草、煙草制品和卷煙煙氣中。目前研究較為深入的TSNAs包括N-亞硝基去甲基煙堿(NNN)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)和4-(N-甲基-N-亞硝胺)-1-(3-吡啶基)-丁酮(NNK)。由于對健康的關注，出現了一系列TSNAs的檢測方法，主要集中在GC-TEA法[1]和LC-MS/MS法[2～4]。然而，GC-TEA法前處理純化步驟多、分析周期長、溶劑耗量大、檢測器專屬性強、樣品通量低、環境污染嚴重，LC-MS/MS法又需要SPE純化的前處理步驟或不能很好地消除基質的干擾。為此，作者在前人工作的基礎上，優化了LC-MS/MS前處理方法，建立了一種快速、準確的TSNAs測定方法。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

超純水，甲醇、乙酸銨、乙酸為色譜純。

標準品：NAB、NAT、NNK、NNN、NAB-d4、NAT-d4、NNK-d4和NNN-d4，純度≥98%，加拿大TRC公司。

API3200QTRAP型質譜儀，美國應用生物系統公司；Waters Acquity型超高效液相色譜儀，美國Waters公司；Cerulean SM450型直線式吸煙機，Cerulean Ltd.；Milli-Q50型超純水儀，美國Millipore公司；KQ-700DE型數控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；CP2245型電子天平(感量0.1 mg)，德國Sartorius公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流速0.4 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；流動相A：甲醇，流動相B：0.2%的乙酸溶液；梯度洗脫條件見表1。

表1 高效液相色譜梯度洗脫條件

1.3 質譜條件

離子源：電噴霧電離源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測MRM；電噴霧電壓：5500 V；離子源溫度：650 ℃；輔助氣Gas1壓力：0.345 MPa；輔助氣Gas2壓力：0.483 MPa；各分析物的定量離子對、定性離子對及碰撞能量(CE)見表2。

1.4 工作溶液

按濃度梯度為1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1配制NNN、NAB、NAT和NNK的標準溶液(甲醇為溶劑，內標NNN-d4、NAB-d4、NAT-d4和NNK-d4的濃度為10 ng·mL-1)。標準系列溶液的內標濃度與樣品的內標濃度相同。

表2 質譜檢測參數表

1.5 樣品制備

將捕集了卷煙煙氣的劍橋濾片放入50 mL錐形瓶中，準確加入10 mL含10 ng·mL-1內標的0.1 mol·L-1乙酸銨溶液超聲萃取30 min后，靜置5 min。取1 mL萃取液過0.22 μm的濾膜到色譜瓶中待分析。

2 結果與討論

2.1 內標的選擇

選擇同位素內標法定量，分別考察了1種和4種內標對檢測結果的影響。結果表明，選擇1種內標NNK-d4定量NAB時，由于離子抑制作用和基質效應的存在，測量結果明顯偏高，此結果與文獻[4]的報道一致。為準確定量考慮，選擇4種內標。

2.2 萃取方式的選擇

對樣品分別進行超聲萃取30 min和振蕩萃取30 min。結果表明，超聲萃取30 min的萃取效率高于振蕩萃取。故選擇超聲萃取的方式。

2.3 萃取時間的選擇

對同一樣品分別超聲萃取10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、50 min。結果表明，超聲萃取30 min以后，NAB、NAT、NNK、NNN的萃取效率均達到一個穩定值，為節約時間并避免引入更多的干擾成分，選擇萃取時間為30 min。

2.4 精密度

對同一樣品進行5次日內和日間平行性測定。結果表明，4種TSNAs日內、日間測定結果的相對標準偏差分別在1.30%～4.53%和1.25%～5.41%之間，說明方法的重復性較好。

2.5 工作曲線

取系列標準工作溶液分別進樣，得到4種TSNAs的工作曲線，線性良好。取最低濃度標準溶液連續10次進樣，計算測定結果的標準偏差，分別用3倍和10倍的標準偏差表示檢出限和定量限。4種TSNAs的標準曲線回歸方程、相關系數、檢出限和定量限見表3。

表3 4種TSNAs的標準曲線回歸方程、相關系數、檢出限和定量限

2.6 回收率

對同一樣品采用樣品加標，在高、中、低三個含量水平進行了回收率的測定，平均回收率均在90%以上，表明本方法的回收率較高。

2.7 樣品測定

對5種市售卷煙樣品主流煙氣中TSNAs進行測定，結果見表4。

表4 5種市售卷煙樣品主流煙氣中TSNAs含量測定結果/ng·cig-1

3 結論

建立了一種高效液相色譜-串聯質譜聯用法測定卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺的方法。采用含內標的0.1 mol·L-1乙酸銨溶液直接對收集了主流煙氣的劍橋濾片進行超聲萃取30 min，過膜后的萃取液用帶電噴霧裝置的LC-MS/MS儀進行分析。該方法數據可靠、操作簡單、重復性好。

參考文獻：

[1] 謝復煒，金永明，趙明月，等.國內外主要品牌卷煙主流煙氣中煙草特有N-亞硝胺的對比分析[J].中國煙草學報，2004，10(5)：8-15.

[2] 朱文靜，楊俊，劉百戰，等.HPLC-MS/MS對卷煙煙氣中4種煙草特有亞硝胺的快速測定[J].分析測試學報，2010，(1)：26-30.

[3] Xiong Wei，Hou Hongwei，Jiang Xingyi，et al.Simultaneous determination of four tobacco-specificN-nitrosamines in mainstream smoke for Chinese Virginia cigarettes by liquid chromatography-tandem mass spectrometry and validation under ISO and "Canadian intense" machine smoking regimes[J].Analytica Chimica Acta，2011，674(1)：71-78.

[4] Wagner K A，Finkel N H，Fossett J E，et al.Development of a quantitative method for the analysis of tobacco-specific nitrosamines in mainstream cigarette smoke using isotope dilution liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Anal Chem,2005,77(4):1001-1006.