分子標記技術在西花薊馬研究中的應用進展

段惠生 張安盛 李麗莉 門興元 張思聰 周仙紅 于毅

摘要：西花薊馬是一種危險性較強的外來入侵害蟲，對我國的農業經濟以及生物多樣性都造成了極大的損失和威脅。本文概述了分子標記技術在西花薊馬的種類鑒定、種群分化、原產地、傳播模式、檢測其捕食天敵的效能和攜帶番茄斑萎病毒(TSWV)等方面的應用，并做了前景展望。

關鍵詞：西花薊馬；分子標記；種類鑒定；種群分化；傳播模式；TSWV

中圖分類號：S433.89文獻標識號：A文章編號：1001-4942(2012)01-0099-05

西花薊馬(Frankliniella occidentalis)屬纓翅目(Thysanoptera)、薊馬科(Thripidae)，是一種世界性入侵害蟲。該蟲原產于美國西部地區，自20世紀80年代后，迅速向外擴散，2003年首次在北京發現，目前該蟲分布遍及全球各大洲。在我國。北京、云南、浙江、山東、貴州和江蘇等省市都已有分布和為害的相關報道。西花薊馬具有極端多食性，不僅本身對農作物危害極大，并且還可以傳播番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)等多屬的植物病毒，造成更嚴重的損失。西花薊馬不僅對世界經濟造成了極大損失，而且對入侵地的生物多樣性構成了巨大的威脅，因此各國學者對其早已展開了多方面深入的研究。從20世紀80年代開始，由于分子生物學的飛速發展，出現了多種多樣的分子標記技術。分子遺傳標記突破了表達型標記的局限性，其變異只來源于基因DNA序列的差異，具有穩定性高、受環境條件的影響較小、信息含量高、不同層次和類群之間廣泛可比等優越性，因而成為遺傳標記中又一強有力的工具，在揭示物種的遺傳變異性研究中發揮著獨特的優勢。分子標記的發展對西花薊馬的研究提供了強有力的技術支持。

分子標記技術目前已出現了幾十種，新的分子標記還會不斷涌現。昆蟲研究常用的一些分子標記方法有，以Southern雜交為基礎的限制性內切酶酶切片段長度多態性(restriction fragmentlength polymorphism，RFLP)和DNA指紋譜；以PCR為基礎的隨機擴增片段長度多態性(randomamplified polymorphic DNA，RAPD)、DNA擴增指紋分析(DNA amplification fingerprinting，DAF)、重復序列引物擴增(simple repeat sequence primer-PCR，SRSP-PCR)、擴增片段長度多態性(ampli-fied fragmemt length polymorphism，AFLP)、單鏈構象多態性PCR(single-strand conformation poly-morphism-PCR，SSCP-PCR)；以重復序列為基礎的簡單重復序列即微衛星DNA標記(simplesequence repeat，SSR)；以mRNA為基礎的mRNA差別顯示反轉錄PCR(mRNA differential displayreverse transcription polymerase chain reaction，DDRT-PCR)、DNA測序(DNA sequencing)以及單核苷酸多態性(Single nucleotide polymor-phism，SNP)。本文概述了分子標記技術在西花薊馬研究中的應用情況，并對其應用前景做了展望。

1.分子標記在西花薊馬研究中的應用

1.1西花薊馬分子鑒定的研究

西花薊馬是一種危險性較強的外來人侵害蟲，對于它的鑒定和分類工作顯得尤為重要。西花薊馬的成蟲在形態上具有明顯的特征，在顯微鏡下可以將其與其它近似種區別，但對于一些殘體、幼蟲以及無法從形態上辨別的蟲體，利用分子標記技術可以準確、快速地鑒定。國內外學者在這方面已經做了大量的工作。Moritz等(2000)采用內轉錄間隔區(internal transcribedspacer，ITS)——限制片段長度多態性(ITS-RFLP)的方法，成功地將西花薊馬和美棘薊馬(Echinothrips americanus Morgan)區分開；Toda和Komazaki(2002)采用ITS2-RFLP法鑒別日本果樹上常見的9種薊馬(包括西花薊馬)的成蟲和幼蟲；Brunner等(2002)根據mtCO I-433bp的擴增產物，結合測序和擴增產物RFLP分析，有效區分了西花薊馬、煙薊馬(Thrips tabaciLindeman)和棕櫚薊馬(Thrips palmi Karny)；林峻賢等(2003)則基于28S rDNA和16S rDNA探討Multiplex-PCR及PCR-RFLP鑒定西花薊馬和煙薊馬的可行性。采用PCR產物直接測序法，游中華等(2007)對包括西花薊馬在內的9種薊馬的mtDNA CO I基因片段(433bp)進行了序列分析，準確地檢測了各蟲態的西花薊馬。

在田間的防治和檢驗檢疫部門日常工作中時常會遇到有多種薊馬的樣本，這就需要用種特異PCR檢測(species-Specific PCR，SSP)。它是利用序列信息已知的DNA片段設計種特異引物進而鑒定薊馬種類。例如周力兵等(2007)利用Brunner等設計的簡并引物mtDNA-7.2F和mtDNA-9.2R擴增出了6種薊馬的mtDNA CO I基因片段，并且設計了西花薊馬特異性引物F.OL1/F.OR和F.OL2/F.OR，該兩對引物能夠將西花薊馬的成蟲、幼蟲、蛹同花薊馬(Fran-kliniella intonsa)、黃胸薊馬(Thrips hawaiiensis)、八節黃薊馬(Thrips flavidulus)、煙薊馬(Thripstabaci Lindeman)和大薊馬(Megalurothrips distal-is)5種薊馬區分。游中華(2008)通過對西花薊馬近緣種的15種薊馬的ITS2序列分析對比，設計了一對西花薊馬特異性引物YW-ITS2-F和YW-ITS2-F，該引物可以準確地將西花薊馬與其它十幾種薊馬區分。孟祥欽等(2010)采用特征序列擴增區域(SCAR)標記技術獲得了對西花薊馬具有特異擴增效果的引物1對(FOMF/FOMR)，該對引物不僅對不同蟲態的西花薊馬具有擴增能力，而且在西花薊馬發生地的寄主植物組織內亦檢測到了其卵的存在。

由此可見，mtDNA CO I和rDNA ITS2基因序列是國內外學者常用于研究西花薊馬分子鑒定的兩種分子標記，這兩種分子標記都有一定的保守性，又具有適當的變異度，同時運用這兩種標記的分子鑒定技術已經十分成熟，操作簡單，鑒定速度快，而且準確，因此得到廣泛的研究應用。

1.2西花薊馬種群分化的研究

種群分化是指同一生物群體在不同的生存環境條件下，經過長期的進化，彼此之間出現了形態

上、行為上和生理上甚至遺傳上不同程度的差異，這種差異或大或小，表現為彼此遺傳關系的遠近。種群的分化，在更多的情況下，是潛在的遺傳差異，為進一步的分化提供著遺傳多樣性的基礎。對于外來入侵害蟲種群，如若在入侵地產生明顯的種群分化，那么將有可能導致該入侵害蟲的大暴發。研究種群內遺傳變異、種群間遺傳分化的過程及程度，對于理解物種的進化趨勢以及種群動態規律具有基礎性的意義，進而對入侵害蟲的治理起到重要指導作用。

目前，利用各種分子標記技術來研究昆蟲種群遺傳分化已經成為昆蟲生態學研究的熱點問題之一。武曉云等(2009)利用PCR技術克隆并分析了西花薊馬的rDNA ITS2和mtCO I基因5'末端的部分序列。結果發現，由于rDNA ITS2變異程度較mtCO I基因大，因此mtCO I基因較rDNA ITS2更適合于西花薊馬的種內遺傳分析；入侵我國的西花薊馬可能是由兩個(或多個)株系或隱存種組成的復合體，并推測入侵我國的西花薊馬以溫室系(greenhouse strain)為主體，也存在一定數量的羽扇豆系(lupin strain)。Brunner等(2010)利用mtCO I基因和微衛星分子標記(SSR)技術對美國西部地區西花薊馬種群進行種群遺傳結構分析，結果表明在起源地西花薊馬種群發生了分化，發現這種遺傳分化與形態上的分化并不一致，并且討論了該地區的種群分化是由棲息地的環境不同(地理隔離)造成的。

用于該方面研究的分子標記技術從先前的用mtCO I、rDNA ITS1、rDNA ITS2基因序列分析，到目前廣泛使用的SSR技術，兩種技術相互補充，能夠得到較為全面的結果。例如對我國的煙粉虱、美國白蛾以及蘋果綿蚜的研究。

1.3西花薊馬原產地及其傳播模式分析

西花薊馬原產于美國西部地區，后來隨著各國花卉業不斷發展，國際間貿易的頻繁逐步擴散到世界各國。2000年，在我國昆明國際花卉節參展的緬甸盆景上首次截獲西花薊馬。目前我國的多個省份已經發現了西花薊馬，對我國的經濟造成了一定的損失，對我國本土的生物多樣性也產生了威脅。研究我國西花薊馬的原產地及其傳播模式，對于重新構建西花薊馬的入侵過程，及時尋找并引進天敵，了解入侵初始種群大小及頻率，闡明生物在入侵過程中或入侵后的生物學變化，預測入侵物種的生物學特性以及借鑒有效的防治措施等具有重要的意義。

對于入侵種的原產地及其傳播模式的研究，傳統的形態學無法做出準確判斷，而利用先進的分子生物學技術，使這一入侵生態學問題得到有效地解決。將我國的西花薊馬種群與國外各地區的種群進行分子遺傳分化的對比分析，計算種群之間的遺傳距離，從而判斷親緣關系的遠近。這方面運用較多且研究較為成功的分子標記技術是利用mtCO I基因和rDNA ITS2基因序列，例如，武曉云等(2009)采用mtCO I基因序列建樹分析云南、北京和哈爾濱的西花薊馬，推斷云南是西花薊馬最早入侵的地點，并且推測3個地區的西花薊馬可能是有相似的入侵來源。國內也有成功運用mtCO I分析種群分化的例子，如褚棟等(2005)基于mtDNA CO I對我國煙粉虱種群與國外煙粉虱種群進行序列分析和構建系統發育樹，結果表明，我國廣大地區暴發成災的煙粉虱為B型煙粉虱，與美國西部地區以及以色列的煙粉虱具有極高的同源性；首次發現Q型煙粉虱入侵我國，而發現的Q型煙粉虱與西班牙、摩洛哥的Q型煙粉虱有極高同源性。

目前對于西花薊馬種群遺傳分析，國內外學者多采用，mtCO I和rDNA ITS2基因序列這兩種手段，但由于這兩種分子標記相對保守，適合于分析遺傳分化較大的生物型或地理種群，對于研究更詳細的原產地分析則需要多態性更高的分子標記，如SSR標記。

1.4西花薊馬天敵的研究

目前西花薊馬僅在我國局部地區分布危害，而且由于其抗藥性強，利用本土天敵進行生物防治是一項有效的措施。目前，西花薊馬的捕食性天敵種類有30余種。國外利用且取得顯著成效的主要包括半翅目的蝽科和捕食螨。捕食性天敵對西花薊馬的控制效能是不一樣的，選擇出控制效能高的捕食陛天敵對于今后生物防治將起到關鍵性作用。

對于捕食者—獵物關系的研究，傳統的形態學方法有多種，但卻有著部分捕食現象觀察難度大、室內難以重建田間植被結構和微環境、難以考慮多種因素的交互作用等局限性，隨著分子生物學技術的發展，這方面的研究技術也就從形態學水平發展到了分子水平。利用分子標記技術能夠靈敏而特異地檢測捕食者體內獵物殘體，從而準確反映出捕食者對西花薊馬的捕食能力的大小。此方面研究應用的分子生物學技術主要為兩類：一類是以蛋白質為研究對象的血清學抗體技術，一類是以DNA為研究對象的分子標記技術。前者常用的分子技術有聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測、多克隆抗體免疫檢測、酶聯免疫吸附法、單克隆抗體技術；，后者常用的有RAPD、RFLP、SCAR、微衛星標記技術、DNA序列中的mtCO I、mtCOⅡ、rDNA ITS2以及實時熒光定量PCR技術。

實時熒光定量PCR技術是在常規PCR的體系內加入熒光染料或帶有熒光染料標記的探針，熒光信號隨著目的DNA的擴增而增強，通過檢測信號判斷目的DNA的數量，進而鑒定標本是否為靶標種類，如棕櫚薊馬、煙薊馬等。孟祥欽(2010)選取mtCO I為標靶DNA，利用TaqMan實時熒光定量PCR法檢測了9種西花薊馬的捕食性天敵，結果表明，捕食性天敵中東亞小花蝽的瞬時捕食能力最強，而異色瓢蟲的捕食能力最低，同時該實驗利用CO I和SCAR分子標記技術建立了本地天敵對西花薊馬捕食作用的定性檢測技術。

分子標記在此方面的研究也是有缺陷的，它不能區分捕食與腐食、二級捕食，因此形態學方法同分子生物學方法應結合運用，發揮各自的優點，從而使得西花薊馬天敵的研究能夠得到長足發展。

1.5西花薊馬體內番茄斑萎病毒(TSWV)的檢測

番茄斑萎病毒((Tomato spotted wilt virus，TSWV)屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)病毒，其傳播介體為薊馬。薊馬由若蟲在病株上取食獲毒，成蟲不能獲毒，但能夠專一性地以持久性的方式傳播，即薊馬一旦獲毒終身能夠傳毒。西花薊馬是番茄斑萎病毒最主要也是最有效的傳播介體。近年來，隨著西花薊馬的不斷擴散，番茄斑萎病毒也在全世界不斷地擴散傳播，造成世界農業經濟損失不斷加重。因此，各國學者逐步重視對西花薊馬攜帶的番茄斑萎病毒的研究。雖然西花薊馬是番茄斑萎病毒最主要的傳播介體，但并不是每個西花薊馬個體中都攜帶有番茄斑萎病毒，因此檢測某地區的西花薊馬體內是否有番茄斑萎病毒顯得尤為關鍵。

檢測薊馬體內的番茄斑萎病毒的方法有很多，像ELISA、電鏡觀察、核酸圓點印跡法以及免疫壓片印跡法。但這些方法在處理高通量的樣本時都存在不同的缺陷，電鏡觀察過于耗費時間，ELISA因為沒有結構性蛋白而靈敏度較差，免疫壓片印跡法在問題的解釋上有一定的困難；除此之外，在ELISA和免疫壓片印跡法都會產生假陽性現象。

TaqMan實時熒光定量PCR(RT-PCR)是常用于檢測薊馬體內病毒的分子標記技術，它免去了PCR后續的檢測步驟，縮短了操作時間，顯著降低了PCR后操作污染的可能性，而且靈敏度更高，可以更加快速、高通量的檢測樣品，同時由于它是定量的，能夠檢測病毒與薊馬間的交互作用。Boonham以西花薊馬的核RNA為標靶，初步探討了利用實時熒光RT-PCR探針檢測西花薊馬體內是否攜帶番茄斑萎病毒的可能性，結果表明，這種方法不僅可以檢測單頭的個體，同時也適合應用于大通量的樣品檢測。

2.小結與展望

從上述事例來看，目前分子標記技術以其靈敏、快速、準確的特點廣泛應用在西花薊馬的研究中，極大地擴展了西花薊馬研究領域，豐富了研究手段。分子標記技術種類繁多，而且每種技術本身都有優缺點，因此在應用的同時應該綜合利弊，選取合適的標記技術，以達到靈敏而準確的目的，以免造成不必要的浪費。

西花薊馬是一種危險性外來入侵害蟲，它的入侵機制、傳播模式等人侵生態學問題是需要我們重點關注的。利用分子生物學技術來研究西花薊馬的生物適應、競爭等成功入侵因素，成為未來我們研究西花薊馬的重點和難點，也是一個重要的突破口。國外對西花薊馬的研究起步早，研究范圍廣，但我國對西花薊馬的研究起步較晚，最早的報道始于2000年。為防止西花薊馬對我國經濟造成的損失不斷加劇，我們在繼續深入地研究西花薊馬的同時，不斷地開發新的技術手段，從而更好地為將來的研究服務。煙粉虱也是一種世界性的入侵害蟲，對全球經濟造成過重大損失，目前各國對其研究已經十分深入而卓有成效，從其生物學特性研究到入侵生態學研究，分子標記技術起到了關鍵性作用。對于西花薊馬的研究，筆者認為可以以煙粉虱研究為模板，結合西花薊馬本身特性以及相關的分子標記，繼續深入展開研究。