基于變性梯度凝膠電泳的青縣蘋果再植障礙園與豐產園土壤細菌多樣性研究

張一 王鳳忠 杜秉海 靳志剛 李妍 韓明渠 周波 毛志泉

摘要：為了分析比較青縣蘋果再植障礙園與豐產園的土壤細菌多樣性，利用Quantity One軟件對變性梯度凝膠電泳(DGGE)圖譜進行多樣性分析，并對DGGE圖譜上的條帶切膠測序，以分析群落結構。結果表明，圖譜各泳帶中的條帶數目相差不大，但其亮度有一定差異；DGGE圖譜的峰圖中，代表豐產園土壤樣品的峰具有較大的峰面積；再植障礙園與豐產園土壤中的主要菌群都屬于γ變形菌亞門(γ-Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、α變形菌亞門(α-Proteobacteria)；僅存在于再植障礙園樣品中的細菌屬于厚壁菌門(Firmicutes)、γ變形菌亞門(γ-Proteobacteria)、放線(Actinobacteria)。可見，環渤海灣蘋果產區豐產園土壤中的細菌群落與再植障礙園相比擁有較高的豐富度，兩種果園有著相似的細菌群落多樣性，造成兩種果園細菌群落結構差異的細菌具有多樣性。

關鍵詞：DGGE技術；土壤細菌多樣性；再植障礙

中圖分類號：S154.38⁺1(222)文獻標識號：A文章編號：1001-4942(2012)01-0071-04

果樹再植障礙(Replant problem)是指果園刨除老樹后重茬栽種新樹時新植樹根系發育不良、幼樹生長緩慢、植株矮小、抗性降低、甚至整株死亡的現象，這種障礙表現在蘋果樹上尤為嚴重。

前人研究結果表明，導致再植障礙的原因多源于土壤，主要與果樹根系生長的土壤理化性質、土壤生物環境的變化以及化感作用有關。同時對再植障礙的發生機理做出了一些合理的解釋，并提出了多種可行的應對措施。近幾年，有關土壤中微生物群落結構變化的研究越來越受到研究者的關注。

果園土壤是一個微生物種類和數量豐富，受人為因素影響較大的復雜的特殊環境。微生物作為物質循環和能量流動的重要參與者，對環境因子的變化非常敏感，在果園土壤生態系統中起著特別重要的作用。因此，研究果園土壤中微生物的群落結構并分析環境因子對此結構的影響，對于了解微生物與這個特殊生態系統的相互關系有很大的幫助，對于研究再植障礙的發生機理有著重要的指導意義。

以往對微生物的研究多建立在傳統的富集、分離、培養基礎上，而在環境樣品中，能用現有技術培養的微生物僅占微生物總種群數的0.01％～10％，難以客觀揭示環境中的微生物多樣性。分子生物技術的應用克服了傳統方法的限制，可以從基因水平上估計種的豐度和均度、查明種的變異情況等，從而可以更客觀地認識環境中微生物的群落組成。基于16S rDNA的微生物多樣性快速監測已成為現代微生物生態學研究的重要手段，其中DGGE(denaturing gradient gel elec-trophoresis)技術是根據DNA在不同濃度變性劑中解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發生變化的原理，將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開，從而對微生物群落進行評價的一種較先進的分子生態學方法。由于其具有快速簡便、分辨率高、重復性好等優點，目前已廣泛應用于各種微生物群落多樣性研究中。

河北青縣位于中緯度季風區，有顯著的大陸性季風氣候特征：一是季風顯著；二是冬寒夏熱，四季分明，春秋短促，氣溫年變差大；三是雨季很短，集中在夏季，7、8兩月降水量占全年的64％～68％，春季少雨，降水量的年際變化也很大。青縣是我國蘋果主要栽植區，但大片果園開始老化，需進行更新，由于土地資源有限，蘋果再植普遍存在。

本試驗以青縣蘋果再植障礙園與豐產園定位取得的樣品為研究對象，研究了青縣蘋果園土壤的細菌群落在不同土層的結構特點及春、夏、秋三季的多樣性變化，并針對兩類果園土壤樣品中細菌群落的特點，從多樣性、群落構成這兩方面進行了探討，力圖發現豐產園與再植障礙園土壤中細菌群落結構的差異性，為蘋果再植障礙發生機理的研究和防治提供科學依據。

1.材料與方法

1.1主要試劑和儀器

E.Z.N.A.Soil DNA Kit和PCR產物純化試劑盒購自美國OMEGA公司；Taq DNA聚合酶、dNTP及相關試劑購自大連寶生物工程公司；所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；基因掃描由上海生工生物工程有限公司完成。

DGGE儀，美國Bio-Rad公司；T-GradientPCR儀，德國Biometra公司；GelDoc-It凝膠成像系統，美國UVP公司；5810R型離心機(冷凍型)，德國Eppendorf公司。

1.2土壤樣品的采集及理化指標的測定

分別于2009年4月28日～5月1日(春季，樣品標記為sp)、7月26日～28日(夏季，樣品標記為su)、10月9日～11日(秋季，樣品標記為au)共3次在河北青縣蘋果園采集土壤樣品。設置再植障礙園(標記為1)與豐產園(標記為2)兩個取樣點，同一取樣點選取0～20cm(標記為a)、20～40cm(標記為b)兩個深度，每個深度重復采樣3次，土壤樣品混勻后于0℃保存。

1.3土壤樣品總DNA的提取

樣品基因組總DNA的提取、純化使用E，Z.N.A.Soil DNA Kit(OMEGA，USA)進行。

1.4 DGGE分析

1.4PCR產物的擴增及定量DGGE使用的上游引物為GC-357F(5'-CGCCCGC-CGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGCGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')，下游引物為517R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')。反應體系為：DNA模板20ng，上下游引物各10pmol，TaqDNA聚合酶2.5U，dNTP(10mmol/L)1μl，10×PCR buffer(不含MgCl₂)5μl，MgCl₂3μl，ddH20補足至50μl。PCR反應條件為：95℃預變性5min；94℃變性1min，56℃復性1min，72℃30s，25個循環；72℃延伸10min，4℃保溫。PCR產物用濃度為0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用PCR產物純化試劑盒純化。

將純化后的PCR產物利用分光光度計測量260nm與280nm下的吸光值，以測定每微升產物中的DNA含量，并精確吸取含有2000ng DNA的PCR產物，-20℃儲存待用。

1.4.2電泳嚴格按照Bio-Rad的DGGE說明手冊步驟操作。

1.4.3連接測序 使用滅菌后的手術刀片將DGGE膠片上的條帶切下，并按順序編號。切下的凝膠置于20μl無菌ddH₂O中，4℃靜置12h后12000 r/min離心1min，得到的上清液即為目的條帶的DNA。

以離心后的上清液為模板，使用上游引物357F(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3')和下游

引物517R(5'-ATFACCGCGGCTGCTGG-3')進行擴增。擴增體系及程序與1.4.1中相同。

將上述擴增產物與pMD18-T Vector連接，送樣測序。

2.結果與分析

2.1青縣蘋果再植障礙園與豐產園土壤樣品的細菌群落的DGGE圖譜

從圖1可以看出，1～12號泳帶中條帶數目相差不大，說明兩種果園土壤中的細菌群落擁有相似的多樣性。其中e、f、h、i、a、j、k、m出現在所有樣品中，代表土壤中的土著細菌群落；L、b、c、d僅出現在再植障礙園的樣品中。

2.2 DGGE峰圖分析

DGGE直觀圖譜中直接反應的信息量較少，所以采用Quantity one對圖1中所示各泳道條帶數目和亮度進行對比分析，其結果如圖2所示。可以看出，所有樣品的峰主要集中于Rf0.3～0.6和Rf0.9～1.0的區域中，這兩個區域的峰擁有較大的峰面積，說明這些峰代表的細菌是環渤海灣蘋果產區果園土壤中的主要細菌類群。豐產園土壤樣品的峰圖擁有較大的峰面積，這說明豐產園土壤中的細菌群落擁有較高的豐富度。

2.3 DGGE圖譜中主要條帶的定性分析

對DGGE圖譜中的主要條帶進行定性分析，結果顯示存在于所有樣品中的條帶e、f、i、k、m代表的細菌類群屬于放線菌門(Actinobacteria)，h代表的細菌類群屬于α變形菌門(α-Proteobac-teria)，a、j代表的細菌類群屬于γ-變形菌亞門(γ-Proteobacteria)；僅存在于再植障礙園樣品中的條帶L、c代表的細菌類群屬于放線菌門(Acti-nobacteria)，b代表的細菌類群屬于厚壁菌門(Fir-micutes)，d代表的細菌類群屬于γ-變形菌亞門(γ-Proteobacteria)。

3.討論與結論

DGGE是一種快速、可靠的檢測土壤微生物群落結構的指紋圖譜技術。本研究利用該技術對環渤海灣蘋果產區再植障礙園與豐產園土壤樣品的細菌群落組成進行對比研究，揭示了此地區蘋果園土壤中細菌組成的多態性。

本試驗通過直觀分析和峰圖對比發現，環渤海灣蘋果產區豐產園土壤中的細菌群落與再植障礙園相比擁有較高的豐富度；兩類果園土壤中的細菌群落擁有相似的多樣性；再植障礙園與豐產園土壤中的主要菌群都屬于厚壁菌門(Firmi-cutes)、γ變形菌門(γ-Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、α變形菌門(α-Proteobacte-ria)；僅存在于再植障礙園樣品中的細菌屬于厚壁菌門(Firmicutes)、γ變形菌門(γ-Proteobacte-ria)、放線菌門(Actinobacteria)。此結果指出了環渤海灣蘋果產區果園土壤中的主要菌群，同時也說明了造成兩種果園細菌群落結構差異的細菌所具有的多樣性。