大白菜GIF蛋白家族的生物信息學分析

王鳳德 李利斌 李化銀 劉立峰 高建偉

摘要：GIF(GRF-interactingfactor)家族是一類含有sNH和QG結構域的蛋白質，可與GRF(Growth reg-ulating factor)轉錄因子蛋白相結合形成功能復合體，通過促進和維持細胞的分裂能力參與調控植物葉器官的發育。本研究系統鑒定了5個大白菜的GIF基因，并對這些基因編碼的蛋白質序列進行了保守性和系統進化分析，最后對BrGIF1基因的表達進行了分析。結果表明，所有的大白菜和擬南芥GIF蛋白家族成員都具有高度保守的sNH和QG結構域。在進化上，G1F蛋白家族可分為兩個不同的亞家族，并且這種特征在大白菜和擬南芥分離之前就已經形成。在表達模式上，BrGIF1基因在具有較大葉球的菜自交系及具有較強細胞分裂能力的組織中的轉錄表達水平較高。另外，BrGIF1基因的表達受到NAA的誘導和ABA的抑制。這些結果表明大白菜GIF蛋白可能具有和擬南芥GIF蛋白相似的生物學功能，在調控植物器官發育中具有重要作用。

關鍵詞：大白菜；GIF蛋白；基因家族；表達模式

中圖分類號：Q781文獻標識號：A文章編號：100－4942(2012)01－0001－06

大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)起源于中國，是我國乃至世界性的重要蔬菜作物之一。葉球是大白菜食用的最主要器官，其大小是目前開展大白菜育種工作所要考慮的一個重要經濟性狀。多年的生產實踐表明，大白菜葉球的大小受嚴格的遺傳控制，受相關基因表達調控的影響。開展大白菜葉球大小相關基因的研究對于從遺傳上控制葉球的大小，提高其產量和品質有重要的理論意義和實用價值。

GIF(GRF—interacting factor)蛋白是植物體內一類轉錄共激活因子，在功能上與人類SYT轉錄共激活因子同源，同屬于SSXT超家族基因。在蛋白結構上，GIF和SYT蛋白都具有明顯的N-末端SNH結構域，但在C-末端二者稍有差別，SYT蛋白在C-末端QPGY結構域富含Gln、Pro、Gly和Tyr氨基酸殘基，而GIF僅富含Gln和Gly氨基酸殘基，因此GIF蛋白的C-末端被稱為QG結構域。已有的研究表明，擬南芥中GIF蛋白家族由3個成員組成，即AtGIF1、AtGIF2、At-GIF3。在這3個成員中，AtGIF1是發現最早也是研究的比較多的一個基因，其N-末端區的SNH結構域可與GRF(Growth regulating factor)轉錄因子結合形成功能復合體，通過促進和維持細胞的分裂能力達到調控植物器官大小的目的。例如，AtGIF1基因功能缺失突變體由于葉細胞數目減少而使得葉片變小、變窄，而過量表達AtGIF1基因的擬南芥植株由于葉細胞數目增多則表現出葉器官增大的表型。此外，近年的研究發現，AtGIF2和AtGIF3基因具有與AtGIF1基因類似的生物學功能，在調控植物細胞分裂能力中也具有重要的作用。

雖然GIF基因的功能在擬南芥中已經有所研究，但GIF蛋白在不同物種間是否具有類似的調控功能尚不得而知。在本研究中，筆者對同屬十字花科的大白菜GIF蛋白家族成員進行了相關的生物信息學分析，并對BrGIF1基因在大白菜中的表達模式進行了研究，以期為揭示GIF蛋白在不同物種間的生物學功能提供依據，同時也為下一步利用基因工程手段提高大白菜產量奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料培養與處理

供試大白菜自交系：Brap-197、Brap-210、Brap-251、Brap-254、Brap-271、 Brap-272、Brap-262、Brap-310、Brap-317、Brap-340為本實驗室自有，挑選籽粒飽滿的種子按濟南地區正常播種期播種在山東省農業科學院蔬菜研究所試驗田內。

大白菜包葉組織收集及葉球大小統計：待大白菜結球期剛剛開始(心葉開始卷曲)時切取卷曲的心葉(包葉)；待大白菜葉球停止生長(休眠期)時對葉球鮮重和最外層球葉大小進行統計。

大白菜不同組織材料收集：待大白菜(Brap-197)長到23～25葉(心葉開始卷曲)時，分別切取包葉、完全展開的蓮座葉、根尖以及短縮莖。

NAA和ABA處理材料收集：將種子(Brap-197)消毒后，28℃、光照16h/黑暗8h周期下，培養皿(墊兩層濾紙)中培養8天，然后用5μmol/LNAA、50μmol/L ABA或者蒸餾水(DW)對大白菜幼苗進行噴霧處理，以葉片上附著細密水珠但不流淌為宜，分別于處理后0、1、3、6、9、12h收集處理葉。

1.2大白菜GIF家族成員搜索

利用已報道的擬南芥GIF蛋白家族成員基因(表1)，通過Blastn程序在NCBI數據庫(http：//WWW.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索相似的基因序列，然后利用DNAMAN軟件預測其編碼氨基酸序列。將預測的編碼氨基酸序列通過Blastp程序在NCBI數據庫進行檢測，若屬于SSXT超家族，則認為其屬于大白菜GIF蛋白家族成員。

1.3序列比對和系統進化樹分析

利用DNAMAN軟件，對大白菜GIF蛋白家族的氨基酸序列進行多序列比對分析，采用默認參數設置。使用MEGA4.0對大白菜和擬南芥中GIF蛋白家族成員做系統進化分析，采用Boot-strap Test-Neighbor Joining方法，重復1000次運算。

1.4表達模式分析

RNA提取和反轉錄分別采用Trizol總RNA提取試劑盒(Invitrogen，美國)和cDNA第一鏈合成試劑盒(Takara，日本)，步驟按試劑盒說明書進行。熒光實時定量PCR(RT-qPCR)使用IQ5實時定量PCR系統(BIO-RAD，美國)和SYBRGreen Master Mix試劑(Takara，日本)。RT- qPCR引物采用Primer Express 2.0軟件(AppliedBiosytems，美國)設計，BrGIF1引物為：BrGIF1-F：5'-ATGCAACAGCACCTGATGCAGATG-3'和BrGIF1-R：5'-TCAGTTCCCATCATCTGAT-GACTT-3'。RT-qPCR反應體系為20μl，引物終濃度為0.25μmol/L，模板為2μl稀釋10倍后的cDNA。反應采用兩步法進行：95℃ 1.5min；然后95℃15s，60℃30s，40個循環，并在全部循環結束后制作融解曲線，檢測是否有引物二聚體生成。大白菜Actin基因(引物為Actin-F：5'-GCTTACGTCGCTCTTGACTACG-3'和actin-R：5'-GATGGTGATGACTTGTCCATCAG-3')作為內參，以cDNA0倍濃度梯度稀釋溶液作為模板制作標準曲線，利用標準曲線法計算基因的相對表達量。每個反應3次重復。并且以未反轉錄

RNA樣品作為對照，防止DNA污染。

2.結果與分析

2.1大白菜和擬南芥GIF家族蛋白的保守序列分析和系統進化分析

通過各種Blast搜索和比對，從現有的大白菜基因組數據中鑒定出5個GIF蛋白家族基因(表1)，分別命名為BrGIF1～BrGIF5(其中BrGIF1～BrGIF4為EST序列，BrGIF5為基因組序列)，這些結果說明大白菜基因組中至少存在5個GIF蛋白家族基因。比擬南芥具有更多GIF基因的原因可能與大白菜基因組比擬南芥的復雜有關。為了確定植物中GIF蛋白的序列特征，用DNAMAN軟件對5個大白菜的和3個擬南芥的GIF蛋白家族的氨基酸全序列進行多序列比對分析，結果表明供試序列之間存在較高的同源性，都具有兩個相對保守的結構域，即位于N-末端的SNH結構域和位于C-末端的富含Gln和G]y的QG結構域(圖1)，這說明供試蛋白之間在生物學功能上可能具有相似性。

根據系統進化樹(圖2)分析，可將大白菜和擬南芥中的GIF蛋白分成I和Ⅱ兩個亞家族，每個亞家族都包含幾個大白菜和擬南芥的GIF基因，表明這一基因家族的基本特征在大白菜和擬南芥分離之前就已經形成，但是GIF蛋白在這兩組中的進化關系各不相同，如在I組中的BrGlF1和BrGIF4和Ⅱ組中的BrGIF2和BrGIF3表現為旁系同源關系。在I組中的AtGIF1和BrGIFl、BrGIF4、BrGIF5之間，以及Ⅱ組中的AtGIF2與

BrGIF2、BrGIF3之間可以歸類為直系同源進化基因，它們在大白菜和擬南芥中可能具有相似的功能。

2.2大白菜BrGIFl基因表達模式分析

為了全面探索大白菜GIF蛋白在調控植物器官大小中的作用，采用RT-qPCR方法，以大白菜肌動蛋白基因Actin為基因表達內部參照，對大白菜BrGIF1基因在結球初期不同品種大白菜包葉中的表達，結球初期大白菜根、莖、蓮座葉和包葉中的表達以及受NAA和ABA處理后的表達模式進行了分析。結果(圖3、圖4、圖5)表明，在結球初期的包葉中，葉球較大的品種具有較高的Br-GIF1轉錄水平，例如Brap-197與Brap-251相比，前者葉球的重量約是后者的10.4倍；而Br-GIF1在結球初期包葉中的表達量前者約是后者的34.6倍，這表明BrGIF1的轉錄表達水平與大白菜的葉球大小之間具有密切的相關性。

對BrGIF1在結球初期不同組織中的轉錄表達水平進行檢測，發現BrGIF1在包葉中表達量最高，其次為根尖，再次為蓮座葉，莖中的表達量最低(圖6)。

在培養8天的大白菜幼苗中，NAA和ABA處理對BrGIF1的轉錄表達影響存在顯著差異(圖7)。NAA處理后1h BrGIF1的轉錄表達水平達到一個相對較高的水平，6h時與DW處理的表達水平類似，6h后BrGIF1的表達量在檢測時限內一直處于上升趨勢。而ABA處理后Br-GIF1的轉錄表達受到抑制，在6h時達到最低水平，然后表達水平開始恢復，并在12h時達到與DW處理類似的水平。在整個處理期間，DW對BrGIF1的表達無明顯影響。這說明NAA處理能誘導BrGIF1的表達，而ABA處理則抑制BrGIF1的表達。

3.結論與討論

本研究利用比較基因組學的方法，以擬南芥GIF蛋白家族基因為搜索對象，從大白菜基因組數據庫中篩選到5個GIF蛋白家族基因。通過對擬南芥和大白菜GIF蛋白家族基因的序列保守性和系統進化分析發現，大白菜和擬南芥GIF蛋白家族之間存在較高的保守性，尤其在SNH和QG結構域的保守性更為明顯，這種序列上的保守性提示大白菜GIF蛋白和擬南芥GIF蛋白之間可能具有功能上的相似性。

在擬南芥中GIF蛋白調控植物器官大小的機制在于促進和/或者維持細胞分裂能力，因此，在具有較強細胞分裂能力的組織或器官中應該具有較強的轉錄活性，例如在擬南芥莖尖和根尖組織可檢測到AtGIF1具有較高的轉錄表達水平，而在最上部的莖和成熟葉中的表達量則相對較低。

為了進一步探索大白菜GIF蛋白家族在調控植物器官大小中的作用，本研究以BrGIF1為代表，利用RT-qPCR的方法研究了其在大白菜中的表達模式。結果表明，BrGIF1在結球初期包葉中的表達水平與大白菜葉球大小之間存在密切的相關性，即較大葉球具有較高的BrGIF1轉錄水平。

BrGIF1在大白菜結球初期的包葉和根中具有較高的mRNA水平，在蓮座葉和莖中則表達量較低，這可能與此時的包葉正處于生長旺盛期，細胞分裂能力較強，而蓮座葉和莖已基本停止生長，細胞分裂能力較弱有關。

生長素是植物體內的一種重要內源激素，在調控植物細胞分裂和生長中具有重要作用，并已被廣泛應用于植物細胞培養的植株再生。在研究中發現，生長素抗性的擬南芥突變體由于細胞數目的減少而使得器官變小。此外，參與調控植物細胞分裂的CycD3；1、COKA；1和BrAR-GOS基因的轉錄表達也受到生長素的調控。與生長素的作用相反，ABA則具有抑制多種植物細胞有絲分裂的能力。在本研究中，筆者分析了BrGIF1對外源NAA和ABA處理的響應，發現BrGIF1的轉錄表達可被NAA誘導，被ABA抑制。

本試驗較系統地研究了大白菜GIF蛋白家族成員的結構特點、系統進化關系，并對其中的一個成員BrGIF1基因的表達模式進行了分析，這對進一步研究GIF蛋白家族在植物發育過程中的調控作用具有重要意義，也為進一步利用基因工程手段改良大白菜品質奠定了基礎。