一種番茄根結線蟲人工培養(yǎng)和保存的優(yōu)化方法

劉麗　顏世翠　姚良同　丁延芹　杜秉海

摘 要：根結線蟲病在世界范圍內對糧食蔬菜水果產量影響嚴重，其人工培養(yǎng)具有依賴寄主植物的局限性。從山東省泰安市房村鎮(zhèn)的日光溫室中采集被根結線蟲侵染嚴重的番茄根系，用機械搗碎-過篩噴淋法從根系樣品中分離根結線蟲和卵，以牡丹根腐病鐮刀菌（Fusarium solani）制作二重培養(yǎng)基，分別接種根結線蟲懸液與卵懸液培養(yǎng)。結果顯示，接種線蟲懸液與卵懸液的平板分別在第三周與第四周線蟲密度達到最高峰，培養(yǎng)基中蟲口密度分別為2 300頭/ml與2 000頭/ml。置培養(yǎng)平板于15℃條件下存放，5個月后培養(yǎng)基內仍有可供繼代繁殖的活蟲體。該優(yōu)化后的方法脫離了寄主植物束縛，簡化了培養(yǎng)過程，具有高效繁殖和長期保存根結線蟲的優(yōu)點。

關鍵詞：根結線蟲；人工培養(yǎng)；牡丹根腐病鐮刀菌；優(yōu)化方法

中圖分類號：S436.412.2+9 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2012）11-0117-04

An Optimized Artificial Culture and Preservation Method

for Tomato Root-knot Nematodes

Liu Li， Yan ShiCui， Yao LiangTong， Ding YanQin， Du BingHai*

（College of Life Science， Shandong Agricultural University /Shandong Key Laboratory of

Agricultural Microbiology， Taian 271018， China）

Abstract Root-knot nematodes seriously decreased the production of crops， fruits and vegetables worldwide， and its artificial culture relied heavily on host plants. In this study， the tomato roots infected by root-knot nematodes were adopted from greenhouse of Fangcun Town， Taian City， Shandong Province， and the root-knot nematodes and eggs were separated by the method of mechanical beating-sifting spray and inoculated to double medium of Fusarium solani. The density of root-knot nematodes was about 2 300 per mini liter medium when inoculated with root-knot nematodes for three weeks and about 2 000 when inoculated with eggs for four weeks. Live root-knot nematodes could still be obtained after 5 months， if the culture plate was preserved at 15℃. This optimized method was independent of host plants， processed more simply， could obtain large quantity of root-knot nematodes in short time and preserve for long time.

Key words Root-knot nematode； Artificial culture； Fusarium solani； Optimized method

根結線蟲（Meloidogyne spp）是一類廣泛分布在世界各地的植物根系定居性內寄生線蟲[1]。根結線蟲屬寄主范圍廣泛，可侵染的植物超過3 000種，分屬114科，如蔬菜、糧食作物、經濟作物和果樹、觀賞植物以及雜草都可被侵染[2，3]。根結線蟲一旦發(fā)生，很難徹底清除，連作期愈長發(fā)病愈重。在溫帶、亞熱帶、熱帶地區(qū)的植物受害比其他地區(qū)更為嚴重，病害可造成作物減產10%～20%，嚴重時可達75%以上，還能傳播一些真菌和細菌性病害[4，5]。

目前關于根結線蟲的分類、生物防治、基因組研究已比較深入，而其培養(yǎng)和保存的研究相對較少。一直以來，對于根結線蟲的培養(yǎng)多利用活體寄主植物如盆栽番茄、擬南芥、辣椒、馬鈴薯、空心菜等，或者是寄主植物的組織培養(yǎng)離體苗和根段外植體的方式，具有作業(yè)量大、過程繁瑣、耗時長的缺點[1]。鮑時翔等（2009）[1]發(fā)明了一種利用香蕉枯萎病鐮刀菌（Fusarium oxysporum fsp cubense）培養(yǎng)和繁殖根結線蟲的方法，解決了根結線蟲的培養(yǎng)依賴寄主植物的問題，但該培養(yǎng)方法存在供試菌種單一、操作過程非常繁瑣復雜的缺陷。本研究小組在其基礎上進行優(yōu)化和改進，簡化培養(yǎng)過程，優(yōu)化操作方法，發(fā)現(xiàn)了另一種可用于根結線蟲人工培養(yǎng)的鐮刀菌——牡丹根腐病鐮刀菌（Fusarium solani），用其制作二重培養(yǎng)基接種根結線蟲懸液或卵懸液，培養(yǎng)出大批量根結線蟲。該方法脫離了寄主植物束縛，操作更為簡便，具有高效繁殖和長期保存根結線蟲的優(yōu)點。

1 材料與方法

11 供試材料

從根結線蟲發(fā)病較為嚴重的山東省泰安市房村鎮(zhèn)的日光溫室中采集根結線蟲侵染嚴重的番茄植株的根系樣品，分離根結線蟲和卵。用于番茄根結線蟲培養(yǎng)的供試菌種為牡丹根腐病鐮刀菌，由山東省農業(yè)微生物學重點實驗室提供。

12 番茄根結線蟲的分離

采用機械搗碎—過篩噴淋法。用清水洗凈番茄根結樣品，用剪刀將發(fā)病重、根結多的根系剪成長約1 cm的小段，放入組織搗碎均漿機中，加適量水搗碎5～10 min，形成線蟲與根組織碎片的混合物。將混合物倒入裝有10% NaClO溶液的三角瓶中，使溶液沒過根系，搖晃三角瓶3 min[6]。再將混合物倒入組合篩上，組合篩自上而下依次為40目、200目、325目和500目。用噴壺形成薄霧噴灑40目篩上的混合物約05 h，使線蟲和卵從根組織內移到表面，被噴霧水沖洗至組合篩的底部。注意調節(jié)好水的流量，以免水溢出使線蟲流失[7]，噴淋后期使用無菌水。噴淋過后，取出組合篩中的325目篩，用無菌水自篩的一側向另一側噴淋沖洗，使線蟲集中到篩的一側，然后再用少量無菌水從篩的背面沖洗篩上物，收集液體到容器中，獲得根結線蟲懸液，并配成200條/ml的濃度。用同法沖洗500目篩，可制備卵懸液。

13 番茄根結線蟲的人工培養(yǎng)方法

131 鐮刀菌菌種的活化 從斜面保藏的牡丹根腐病鐮刀菌菌種中挑取一小塊接種到PDA培養(yǎng)基中活化，在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。

132 鐮刀菌種子液的制作 從活化好的真菌中挑取1個菌塊接種在容積為100 ml內裝50 ml液體PDA培養(yǎng)基的三角瓶中，于轉速180 r/min、溫度28℃條件下培養(yǎng)2 d即可獲得真菌的種子培養(yǎng)液。

133 二重培養(yǎng)基的制備 將獲取的真菌種子培養(yǎng)液以每板01 ml的量均勻涂布至固體PDA培養(yǎng)基中，在28℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d左右，待整個培養(yǎng)皿長滿菌絲后即為二重培養(yǎng)基。用于制作二重培養(yǎng)基的PDA平板要適當增厚，以延長根結線蟲的培養(yǎng)時間。

134 根結線蟲懸液的制備 見本文“12”番茄根結線蟲的分離（采用機械搗碎-過篩噴淋法）。

135 根結線蟲的接種與培養(yǎng) 無菌條件下，將制備好的根結線蟲懸液05 ml（約100條）或卵懸液05 ml（約100個），接至二重培養(yǎng)基圓心處，合蓋靜置1～2 h使液滴浸沉，用膜封口，在28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)[1]。

從第二周開始，在根結線蟲培養(yǎng)平板上菌絲消失區(qū)域均勻取樣，用樣品中的線蟲數估算每毫升培養(yǎng)基中的線蟲數。具體方法為：用半徑為35 mm的打孔器，打孔取培養(yǎng)基樣品至24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2塊培養(yǎng)基樣品、1 ml無菌水，攪拌均勻。每孔取40 μl混合液至96孔細胞培養(yǎng)板，在倒置顯微鏡下計數，每孔重復3次觀察計數，計算24孔細胞培養(yǎng)板每孔中線蟲蟲體數目，然后估算每毫升培養(yǎng)基中的線蟲數，統(tǒng)計3個線蟲培養(yǎng)平板，每周測1次，直至第9周。

136 培養(yǎng)線蟲的存放 對于已經進入繁殖高峰期的根結線蟲培養(yǎng)平板，要轉入冷涼條件下存放，可置15℃培養(yǎng)箱內[8]。

14 從培養(yǎng)平板獲取根結線蟲懸液或卵懸液

無菌條件下，在根結線蟲培養(yǎng)平板上取適量培養(yǎng)基于容積為100 ml內裝40 ml無菌水的三角瓶中，封口，于180 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)10 min，使線蟲與水充分混合。在搖好的混合液中加入10% NaClO溶液21 ml，使混合液中NaClO濃度為05%，搖晃3 min[9]。然后將混合液倒入組合篩上。用本文12 中過篩噴淋的方法獲取根結線蟲懸液或卵懸液，并配置成所需濃度。

15 從培養(yǎng)平板獲取根結線蟲二齡幼蟲懸液

根結線蟲卵孵化的二齡幼蟲是在整個線蟲生活周期中對寄主植物根系具有侵染力的階段，因此獲取根結線蟲二齡幼蟲懸液具有重要意義。具體方法為：將根結線蟲培養(yǎng)平板置于倒置顯微鏡下，用解剖針挑取其中的卵粒，置于200目網篩里，先將網篩置于05% NaClO溶液中搖晃3 min，然后置清水中1 min，并沖洗3次，再將網篩置培養(yǎng)皿中并使皿中的清水剛好沒過篩底的卵粒，置28℃培養(yǎng)箱中孵化，每隔24 h收集皿內的二齡幼蟲[9，10]，收集3次，將收集的線蟲二齡幼蟲懸液配至所需濃度，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

16 線蟲傳代培養(yǎng)方法

為了獲得持續(xù)和穩(wěn)定的根結線蟲源，需要對進入蟲體繁殖密度低谷期的根結線蟲培養(yǎng)平板進行換板傳代。用本文“14”中的方法獲取根結線蟲懸液或卵懸液，然后用“13”中的方法，將懸液接種于二重培養(yǎng)基中，可繼續(xù)培養(yǎng)根結線蟲。

2 結果與分析

21 番茄根結線蟲培養(yǎng)平板的變化及分析

用牡丹根腐病鐮刀菌制作二重培養(yǎng)基培養(yǎng)根結線蟲過程中發(fā)現(xiàn)，接種根結線蟲懸液的平板，一周后中央接種處的菌絲開始消退，消退圈逐漸向四周延伸；培養(yǎng)兩周時平板如圖1所示；培養(yǎng)二周半時平板菌絲即完全消失，剩下黃褐色局部暗褐色的潮濕裸露的培養(yǎng)基，而且此時培養(yǎng)基具有軟度大、較松散、難以用鑷子夾取等特點。對于接種卵懸液的平板，試驗結果與接種線蟲懸液的平板相似，只是中央菌絲消失時間要比接種線蟲懸液的平板晚，兩周時菌絲開始消退，三周半左右才可消失完全。

圖1 接種根結線蟲懸液二周時的線蟲培養(yǎng)平板圖片

由平板變化現(xiàn)象可知，接種線蟲懸液后，線蟲需要一段時間來適應平板環(huán)境，然后才開始取食菌絲。而接種卵懸液的平板菌絲消失時間要比接種線蟲懸液的平板晚，這是由于卵適應平板環(huán)境后還需要先孵化成二齡幼蟲，然后再取食菌絲所致。

22 根結線蟲的密度變化

由圖2可知，在接種線蟲懸液的平板內，根結線蟲不斷繁殖，到第三周線蟲密度達到最高峰，約為2 300頭/ml培養(yǎng)基，然后隨著時間的延長，平板內菌絲減少，空間擁擠，代謝廢物增加，使根結線蟲生存條件下降，線蟲蟲口密度不斷降低，到第九周時，線蟲密度約為120頭/ml培養(yǎng)基，僅為高峰期的5%。接種卵懸液的平板，在第四周蟲口密度達到最高峰，約為2 000頭/ml培養(yǎng)基，第九周時，蟲口密度約為240頭/ml培養(yǎng)基，為高峰期的12%。從線蟲密度總變化趨勢來看，在第六周進行根結線蟲換板傳代培養(yǎng)最適宜。第四周到第九周，蟲體密度變化趨勢在局部（接種線蟲懸液的平板在第七周，接種卵懸液的平板在第五周）呈不正常凹陷，可能是因為平板內部分區(qū)域線蟲蟲體密度不均所致，但不影響蟲口密度變化總趨勢。將牡丹根腐病鐮刀菌菌絲完全消退后的根結線蟲培養(yǎng)平板轉入15℃條件下存放，5個月后培養(yǎng)基內仍有可供繼代繁殖的活蟲體。

圖2 平板在接種線蟲或卵后不同時期

線蟲密度數量統(tǒng)計3 結論與討論

根結線蟲的分類研究已十分深入，生防研究也已在世界各國廣泛開展，而關于根結線蟲培養(yǎng)保存的研究卻相對較少[1]。國外一些學者將根結線蟲在離體擬南芥和番茄上進行繁殖[11，12]，但試驗條件要求高，要在嚴格無菌條件下。Barker等人介紹的根結線蟲繁殖方法，設備和程序復雜，不易應用[13]。王汝賢等（1999）[13]在Lambert等（1992）水培法[14]的基礎上簡化改進，形成根結線蟲的一種水培繁殖方法。吳慶麗等（2006）[15，16]在比較根結線蟲在番茄和馬鈴薯上培養(yǎng)效果的基礎上，研究了不同馬鈴薯品種對根結線蟲的培養(yǎng)效果，并對其光照條件進行了研究。焦春偉等（2012）[17]利用空心菜適應性強且在沙培澆灌營養(yǎng)液條件下生長周期長、易管理的特點，用其培養(yǎng)爪哇根結線蟲和花生根結線蟲取得較好效果。目前國內外根結線蟲的人工培養(yǎng)主要還是依靠盆栽番茄、擬南芥、辣椒、馬鈴薯、空心菜或其他寄主植物，存在作業(yè)量大、周期長、寄主對環(huán)境條件的適應性差、過程繁瑣或不易管理等問題[16]。鮑時翔等（2009）[1]用香蕉枯萎病鐮刀菌培養(yǎng)植物根結線蟲取得較好效果，但其方法存在供試菌種單一，操作過程非常繁瑣復雜的缺陷。

本試驗在鮑時翔方法的基礎上對其培養(yǎng)方法進行優(yōu)化和改進，簡化培養(yǎng)過程，優(yōu)化操作方法，發(fā)現(xiàn)了一種可用于根結線蟲培養(yǎng)的新鐮刀菌——牡丹根腐病鐮刀菌，解決了根結線蟲培養(yǎng)長期依賴寄主植物和培養(yǎng)過程繁瑣的問題，具有脫離寄主植物束縛、操作簡便、高效繁殖和長期保存根結線蟲的優(yōu)點。該方法培養(yǎng)的根結線蟲活性不變，其二齡幼蟲對番茄幼苗依然具有侵染活性，其制備的根結線蟲二齡幼蟲懸液和卵懸液，可在許多研究如植株的抗線蟲性[18]、根結線蟲病害的生物防治、線蟲的分類鑒定、基因組學研究等工作中使用，為根結線蟲的進一步研究提供了便利。參 考 文 獻：

[1] 鮑時翔，曾慶飛，方 哲，等一種植物根結線蟲人工培養(yǎng)及繁殖保存的方法[P]中國專利，2009

[2] 劉志維植物線蟲志[M]北京：中國農業(yè)科技出版社，2004

[3] Agrios G NPlant Pathology[M]New York：Academic Press，1997

[4] 鄢小寧，林茂松，劉亮山南方根結線蟲拮抗鏈霉菌的篩選和鑒定[J]中國生物防治，2004，20（3）：202-205

[5] 趙 鴻，彭德良，朱建蘭根結線蟲的研究現(xiàn)狀[J]植物保護，2003，29（6）：6-9

[6] 張小艷，張 榮，毛 琦，等陜西省蔬菜根結線蟲拮抗真菌的分離與初步鑒定[J]干旱地區(qū)農業(yè)研究，2007，25（4）：62-64

[7] 王壽華果樹線蟲學[M]北京：中國農業(yè)科技出版社，1994

[8] 龐林海，杜愛芳，李孝軍，等秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)特性與保存方法研究[J] 浙江農業(yè)學報，2007，19（1）：34-36

[9] 李洪濤，張翠綿，沈江衛(wèi)，等黃瓜根結線蟲拮抗菌篩選及作用機理初探 [J] 河北大學學報，2006，26（1）：91-96

[10] 楊文香，袁勝亮，劉大群 蔬菜根結線蟲在我國的發(fā)生及防治現(xiàn)狀[J] 河北省植物病理學研究，2003，1：391-397

[11] Hutangura P， Jones M G K，Heinrich T.Optimisation of culture conditions for in vitro infection of tomato with the root-knot nematode Meloidogyne javanica [J].Australasian Plant Pathology，1998，27：84-89.

[12] Sijmons P C， Grundler F M W， von Mende N， et al.Arabldopsis thaliana as a new model host for plant-parasitic Nematodes[J] The Plant Journal，1991，1（2）：245-254.

[13] 王汝賢，王 剛根結線蟲的一種水培繁殖方法[J] 植保技術與推廣，1999，19（5）：8-9

[14] Lambert K N， Tedford E C， Caswell E P，et a1 A system for continuous production of root-knot nematode juveniles in hydroponic culture[J] Phytopathology， 1992，82：512-515

[15] 吳慶麗，陳海燕，廖金鈴，等馬鈴薯培養(yǎng)根結線蟲效果的研究[J] 華南農業(yè)大學學報，2006，27（4）：26-28

[16] 吳慶麗，王 鮮，廖金鈴，等不同光溫條件對馬鈴薯繁殖根結線蟲效果的影響[J]植物保護，2006，32（6）：27-29

[17] 焦春偉，徐春玲，謝 輝，等用沙培空心菜繁殖根結線蟲效果的研究[J] 西北農林科技大學學報（自然科學版），2012，40（3）：126-130

[18] 金國良，王 富，霍雨猛，等耐根結線蟲瓜類砧木的篩選[J] 山東農業(yè)科學，2010，5：89-91 山 東 農 業(yè) 科 學 2012，44（11）：121～124