海藻酸鈉固定化脂肪酶的制備及性質(zhì)研究

金紅娣 王巧映 余凱 董華平

摘 要:本文采用海藻酸鈉包埋法得到了固定化脂肪酶。通過條件優(yōu)化得到了最佳固定化條件:海藻酸鈉濃度1.5%,CaCl2濃度3%,固定化時(shí)間為1h。該固定化脂肪酶連續(xù)反應(yīng)4批之后,酶活保持穩(wěn)定,顯示了較好的催化穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞:海藻酸鈉脂肪酶固定化催化穩(wěn)定性

中圖分類號(hào):TQ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1674-098X(2012)05(b)-0142-01

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3),又稱甘油三酯水解酶,是一類能催化長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油酯水解為甘油和長(zhǎng)鏈脂肪酸的酶類,許多脂肪酶還能催化酯化反應(yīng)酯交換反應(yīng)、醇解反應(yīng)、酸解反應(yīng)以及氨解反應(yīng)等。目前,脂肪酶已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、皮革、日用化工等行業(yè)。但游離脂肪酶穩(wěn)定性差、容易失活、難以回收利用等缺點(diǎn),限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。通過固定化技術(shù),將脂肪酶固定化在一定的載體上可以提高活力和穩(wěn)定性,而且易于回收重復(fù)使用,因此酶固定化技術(shù)被廣泛地應(yīng)用,以降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率[1～2]。海藻酸鈉作為一種生物相容性較好、機(jī)械強(qiáng)度較高、對(duì)酶蛋白無毒副作用的高分子載體,經(jīng)常用于酶催化劑的固定化[3～4]。

本文以海藻酸鈉作為載體,制備固定化脂肪酶,并對(duì)固定化條件和酶學(xué)性質(zhì)作了詳細(xì)的研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

恒流泵(蘇州江東精密儀器有限公司,BT-100B),恒溫水浴振蕩器(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠,SHZ-88A),多能攪拌器(金壇市白塔金昌實(shí)驗(yàn)儀器廠,HJ-5),分析天平(AB204-N)。

海藻酸鈉(生物級(jí),阿拉丁試劑(上海)有限公司),牛胰脂肪酶(13-35units/mg),橄欖油(分析純,阿拉丁試劑(上海)有限公司),聚乙烯醇(分析純,阿拉丁試劑(上海)有限公司),其余試劑均為分析純。

1.2 固定化脂肪酶的制備

將海藻酸鈉加熱溶解,使海藻酸鈉最終濃度為1.5%(w/v),冷卻后使海藻酸鈉溶液與微生物細(xì)胞混合均勻,用蠕動(dòng)泵滴入3.0%(w/v)的CaCl2溶液中,固定化一定時(shí)間后,濾出顆粒,用0.9%(w/v)生理鹽水洗凈后,浸在相同濃度的生理鹽水中備用。

1.3 固定化脂肪酶活性的檢測(cè)

取0.5g固定化脂肪酶加到2ml底物(按比例橄欖油∶聚乙烯醇∶緩沖液=1∶3∶5)中,于30℃下,水浴恒溫振蕩器中反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后,用0.1mol/L的NaOH溶液滴定,酚酞作為指示劑。酶活定義:在反應(yīng)條件下,每分鐘水解形成1μmo1脂肪酸所需酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈉濃度對(duì)酶活的影響

海藻酸鈉的濃度會(huì)影響固定化酶的機(jī)械強(qiáng)度以及物質(zhì)的在顆粒內(nèi)部的擴(kuò)散,進(jìn)而影響催化劑的活性。如圖1所示,當(dāng)海藻酸鈉濃度為1.5％時(shí),固定化酶的活力最大,所以選擇海藻酸鈉最適濃度為1.5％。(如圖1)

2.2 CaCl2濃度對(duì)酶活的影響

將1.5%海藻酸鈉溶液與酶液混合后用蠕動(dòng)泵分別滴入1,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0%(w/v)濃度的CaCl2溶液中,固定化1小時(shí)后,濾出顆粒,用生理鹽水洗凈,測(cè)定固定化酶的活性,結(jié)果如圖2所示。當(dāng)CaCl2濃度為3％時(shí),固定化酶活性最高。(如圖2)

2.3 固定化時(shí)間的考察

將1.5%海藻酸鈉溶液與酶液混合后用蠕動(dòng)泵滴入3%的CaCl2溶液中,分別固定化0.5、1、1.5、2、2.5、3h后,濾出顆粒,用生理鹽水洗凈,測(cè)定固定化酶的活性。結(jié)果如圖3所示。有圖可知,開始固定化時(shí),固定化酶的活性呈升高趨勢(shì),到1h時(shí)固定化酶活達(dá)到最大;隨著固定化時(shí)間延長(zhǎng),固定化酶的活性又逐漸降低,這可能是因?yàn)殡S著固定化時(shí)間延長(zhǎng),海藻酸鈉中的Na+逐漸被Ca2+替換,高分子結(jié)構(gòu)致密,底物擴(kuò)散阻力增加。所以固定化最佳時(shí)間為1h。(如圖3)

2.4 固定化酶批次穩(wěn)定性考察

將每一批次固定化脂肪酶反應(yīng)后用蒸餾水潤(rùn)洗,然后繼續(xù)進(jìn)行下一批實(shí)驗(yàn),測(cè)定每一批次的固定化酶酶活。在前四批反應(yīng)過程中,固定化酶的酶活保持穩(wěn)定性,第五批之后,酶活有了明顯的下降,到第7批,酶活下降為零,這可能是由于固定化顆粒崩解所致。

3 結(jié)語

本文采用直接包埋法制備了海藻酸鈉固定化脂肪酶,對(duì)固定化條件進(jìn)行了優(yōu)化,得到了催化活性較高、穩(wěn)定性較好的固定化脂肪酶。

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