大花蕙蘭原球莖的誘導(dǎo)、增殖及植株再生研究

季華 吳偉劍 吳華 等

摘要：從大花蕙蘭（Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｈｙｂｒｉｄｕｍ）試管苗取材，誘導(dǎo)原球莖，建立植株再生體系，分析了不同激素及其濃度對原球莖誘導(dǎo)、增殖和植株生根的影響。結(jié)果表明，不定芽比葉片更容易誘導(dǎo)出原球莖；生長素ＮＡＡ對原球莖的誘導(dǎo)效果好于２，４－Ｄ，最適合原球莖誘導(dǎo)的激素組合為１．０ ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ；原球莖增殖培養(yǎng)基中添加１．０ ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ增殖效果較好，增殖系數(shù)可達(dá)７．９0；最適生根培養(yǎng)基為１／２ ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋３０ ｇ／Ｌ蔗糖。

關(guān)鍵詞：大花蕙蘭（Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｈｙｂｒｉｄｕｍ）；原球莖；組織培養(yǎng)；植株再生

中圖分類號：Ｓ６８２．３１；Ｓ６０３．６文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）15－3369-03

Ｓｔｕｄy ｏｎ Ｐrotocorm Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｌａｎｔｌｅｔ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ

Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｈｙｂｒｉｄｕｍ

ＪＩ Ｈｕａ１，ＷＵ Ｗｅｉ－ｊｉａｎ２，ＷＵ Ｈｕａ１，ＣＨＥＮ Ｌｏｎｇ－ｑｉｎｇ１

（１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｏｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｗｕｈｕ Ｆａｒｍ， Ｈｕａｎｇｐｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｗｕｈａｎ ４３０３４５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｅｘｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｄｒａｗｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｈｙｂｒｉｄｕｍ ｐｌａｎｔｌｅｔ ｆｏｒ ｐrotocorm ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｎｔｌｅｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｋｉｎｄ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｎ ｐrotocormｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｐrotocorm ｆｒｏｍ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｅａｓｉｌｙ ｔｈａｎ ｆｒｏｍ ｌｅａｆ ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ． ＮＡＡ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｐrotocorm ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈａｎ ２，４－Ｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐrotocorm ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ １．０ ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ． Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｐrotocorm ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ （７．９0） ｉｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｄｄｉｎｇ １．０ ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｒｏｏｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗａｓ １／２ ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋ ３０ ｇ／Ｌ ｓｕｃｒｏｓｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｈｙｂｒｉｄｕｍ； ｐrotocorm； ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ

大花蕙蘭（Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｈｙｂｒｉｄｕｍ）是蘭科蘭屬中大花型附生種類的雜交種，具有花大色艷、花多且花期長的特點(diǎn)，深受大眾喜愛［１］。大花蕙蘭的繁殖方式主要以分株為主，由于長期無性繁殖，造成帶病毒植株日益增多，使蘭花的品質(zhì)下降；同時(shí)新品種的培育也對繁殖方式和快繁技術(shù)提出了需求。目前，蘭屬植物的組織快繁主要是以原球莖（Ｐｒｏｔｏｃｏｒｍ－ｌｉｋｅ ｂｏｄｙ，ＰＬＢ）為外植體誘導(dǎo)出愈傷組織或胚性愈傷組織，進(jìn)而獲得小植株［２－８］。國內(nèi)對大花蕙蘭組織培養(yǎng)［９－１６］多數(shù)是采用莖尖、側(cè)芽為外植體，通過誘導(dǎo)原球莖獲得小植株。本實(shí)驗(yàn)以大花蕙蘭試管苗的不定芽和葉片為外植體，誘導(dǎo)和增殖原球莖，建立大花蕙蘭的快速繁殖體系，以達(dá)到加大試管苗繁殖系數(shù)、簡化繁殖步驟的目的。

１材料與方法

１．１材料

供試材料為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院種質(zhì)資源實(shí)驗(yàn)室的大花蕙蘭試管苗。

１．２方法

１．２．１原球莖的誘導(dǎo)從長勢良好的大花蕙蘭試管苗上取大小一致、高２～３ ｍｍ的不定芽及葉片作為外植體，將葉片切割成０．５～１．０ ｃｍ２的小塊。外植體接種在ＭＳ＋３０ ｇ／Ｌ蔗糖＋６ ｇ／Ｌ瓊脂培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基中添加不同濃度的ＢＡ、ＮＡＡ或２，４－Ｄ，激素濃度組合見表１。每處理接種６個(gè)外植體，重復(fù)３次。在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（２５±２） ℃，光照１４ ｈ／ｄ，光照度２ ０００ ｌｘ，３０ ｄ后統(tǒng)計(jì)各處理原球莖的誘導(dǎo)率。

１．２．２原球莖的增殖以ＭＳ為基本培養(yǎng)基，附加３０ ｇ／Ｌ蔗糖和６ ｇ／Ｌ瓊脂，ｐＨ ５．５～５．８，添加不同濃度的ＢＡ和ＮＡＡ（表２）。每處理接種１５個(gè)不定芽，重復(fù)３次，培養(yǎng)條件同１．２．１，培養(yǎng)４０ ｄ后統(tǒng)計(jì)外植體增殖系數(shù)。

１．２．３生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)以１／２ＭＳ為基本培養(yǎng)基，附加６ ｇ／Ｌ瓊脂和質(zhì)量分?jǐn)?shù)０．５％的活性炭，添加不同濃度的ＮＡＡ與蔗糖（表３），ｐＨ ５．５～５．８。每處理接種１５個(gè)不定芽，重復(fù)３次，培養(yǎng)條件同１．２．１。６０ ｄ后統(tǒng)計(jì)外植體的苗高、根長大于１ ｃｍ的根數(shù)目、根長和生根率。

１．２．４煉苗移栽將生根培養(yǎng)得到的大花蕙蘭試管苗煉苗移栽，以水苔為栽培基質(zhì)，移栽前用無菌水將植株根部的培養(yǎng)基沖洗干凈，再植入穴盤，移入遮陰棚中培養(yǎng)。每天向葉片噴水?dāng)?shù)次，每周澆施１～２次稀釋的營養(yǎng)液。

２結(jié)果與分析

２．１原球莖的誘導(dǎo)

將大花蕙蘭葉片和不定芽接種到含不同激素配比的培養(yǎng)基，３０ ｄ后原球莖的誘導(dǎo)結(jié)果見表１。誘導(dǎo)３０ ｄ后，處理Ａ１～Ａ４的葉片有腫脹膨大的現(xiàn)象，但沒有誘導(dǎo)出原球莖；而處理Ａ５～Ａ８的腋芽周圍有綠色半透明顆粒狀組織產(chǎn)生并逐漸長大，即誘導(dǎo)產(chǎn)生的原球莖（圖１），說明不定芽較葉片易發(fā)生再分化產(chǎn)生原球莖。其中Ａ６處理的原球莖誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)７６．９％。培養(yǎng)基中ＢＡ濃度相同時(shí)，１．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ的誘導(dǎo)效果要好于０．５ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ；隨著ＢＡ濃度的增高，兩種生長素的誘導(dǎo)率都有所增加。可見實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)原球莖誘導(dǎo)的最佳激素濃度組合為１．０ ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ。

２．２原球莖的增殖培養(yǎng)

增殖培養(yǎng)４０ ｄ后，不定芽周邊長出新的原球莖（圖２），一般產(chǎn)生５～８個(gè)，最多達(dá)到１５個(gè)（表２）。激素ＢＡ和ＮＡＡ的濃度不同，增殖系數(shù)也會(huì)發(fā)生變化。Ｂ５處理，即ＢＡ和ＮＡＡ的濃度分別為１．０ ｍｇ／Ｌ和０．５ ｍｇ／Ｌ時(shí)增殖系數(shù)最高，為７．９０。ＢＡ和ＮＡＡ濃度過高或過低均不利于原球莖的增殖。

２．３生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)獲得的大花蕙蘭原球莖轉(zhuǎn)移到含不同濃度ＮＡＡ和蔗糖的生根培養(yǎng)基上，２０ ｄ后各處理陸續(xù)有根形成，并有新的葉片展開。培養(yǎng)６０ ｄ后各處理生根及苗生長情況見表３和圖３。

由表３可知，大花蕙蘭原球莖的生根情況較好，除Ｃ１處理外，其他處理的生根率均達(dá)到１００.0％。在相同的蔗糖濃度條件下，ＮＡＡ濃度對各處理之間苗高、葉片數(shù)和根長的影響不顯著。而ＮＡＡ為０．５ ｍｇ／Ｌ時(shí)，較高的蔗糖濃度對植株苗高有顯著的促進(jìn)作用。各處理中，Ｃ４（０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋３０ ｇ／Ｌ蔗糖）處理的幼苗生長情況最好，試管苗苗高、葉片數(shù)、根長均大于其他處理，其中苗高和根長顯著大于其他處理。

２．４煉苗移栽

移栽培養(yǎng)７ ｄ后，幼苗未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，但部分移栽苗葉尖變黃，且大多發(fā)生于較小的植株，較大的植株則生長良好。說明試管苗個(gè)體越大、越健壯，移栽后的生長狀況越好，移栽越易成活。一般適于移栽的植株要求苗高５ ｃｍ以上、具有展開葉３～５片，以及２條以上長度大于１ ｃｍ的根。

３討論

在以葉片為外植體誘導(dǎo)原球莖時(shí)，葉片雖有膨大的現(xiàn)象，但生長３０ ｄ左右后葉片逐漸死亡，沒有原球莖產(chǎn)生，與Teixeira da silva等［１７］的報(bào)道一致，葉片誘導(dǎo)原球莖不成功可能與激素的種類有關(guān)［１８］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)２，４－Ｄ的誘導(dǎo)效果沒有ＮＡＡ好，與Ｈｕａｎ等［５，６］的報(bào)道是一致的，實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)１．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ＢＡ對原球莖的誘導(dǎo)效果好，這與徐宏英等［１１］的結(jié)果略有差異，可能與試管苗體內(nèi)的激素濃度變化有關(guān)。傳統(tǒng)的增殖方式主要是由原球莖直接獲得生根的小植株；也有的以初次誘導(dǎo)的原球莖或原球莖薄層細(xì)胞為外植體誘導(dǎo)出愈傷組織或胚性愈傷組織，獲得增殖的原球莖后再獲得小植株［１９，２０］。本實(shí)驗(yàn)中以不定芽為外植體，有原球莖的形成，但未見愈傷組織形成。增殖培養(yǎng)４０ ｄ后增殖系數(shù)均在４．６7以上，１．０ ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ的增殖效果最好，增殖系數(shù)達(dá)７．９0，高于以往的報(bào)道［２１］。在生根實(shí)驗(yàn)中，較高濃度的ＮＡＡ和蔗糖有利于根的生長和植株伸長，可適當(dāng)縮短生根時(shí)間，對移栽后植株的生長有利。

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