滇楊的增殖及生根培養研究

辛培堯 劉巖 孫正海 等

摘要：以滇楊（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｄｏｄｅ）組織培養獲得的不定芽為原材料進行增殖培養和生根培養，考察培養基中激素濃度對不定芽增殖和試管苗生根的影響。結果表明，ＭＳ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．０２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ是適合滇楊不定芽增殖的培養基。１／２ＭＳ培養基中添加０．０２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ有利于試管苗的生根。

關鍵詞：滇楊（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｄｏｄｅ）；組織培養；增殖；生根

中圖分類號：Ｓ７９２．１１８；Ｓ７２３．１＋３２ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）15－3366-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｏｏｔｉｎｇ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ

ＸＩＮ Ｐｅｉ－ｙａｏａ，ｂ，ＬＩＵ Ｙａｎｂ，ＳＵＮ Ｚｈｅｎｇ－ｈａｉｂ，ＺＨＯＵ Ｊｕｎａ，ｂ，ＴＡＮＧ Ｊｕｎ－ｒｏｎｇｂ，ＨＥ Ｃｈｅｎｇ－ｚｈｏｎｇａ，ｂ，ＤＵＡＮ Ａｎ－ａｎａ

（ａ． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ ｏｆ Ｃｈｉｎａ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｏｉｎ；

ｂ． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ， Ｓｔａｔｅ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，

Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２２４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｏｔｉｎｇ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Dode ａｓ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＭＳ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ ＋０．０２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ ｗａｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄｓ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ； ａｎｄ １／２ＭＳ＋０．０２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ ｗａｓ ｇｏｏｄ ｆｏｒ ｒｏｏｔｉｎｇ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｏｐｕｌｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｄｏｄｅ； ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ； ｒｏｏｔｉｎｇ

滇楊（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｄｏｄｅ）屬楊柳科楊屬青楊派樹種，又名云南白楊，具有適應性較強、生長較快、成材較早、分布海拔變幅大（１ ３００～３ ２００ ｍ）、易于繁殖等特點，是中國乃至世界少有的分布于低緯度高海拔地區的寶貴楊樹資源，也是中國西南地區特有的一種鄉土樹種［１］。由于滇楊主要分布在云南、四川及貴州等環境復雜、植物種類繁多的地區，而且人們對其認識程度各異，使得滇楊的種質資源保護、開發與利用等工作一直沒能得到足夠的重視［２］。隨著胡楊派、白楊派、青楊派、黑楊派以及大葉楊派中的多個種或雜種離體培養再生體系的成功建立［３］，使得利用楊樹組織培養對其種質進行保存以及創新成為現實。本研究將滇楊嫩莖誘導的不定芽接種在不同的增殖和生根培養基上，探討滇楊組織培養中較佳的增殖及生根培養方案，可為進一步對滇楊進行種質資源的保存、誘變育種以及轉基因育種等研究提供理論指導與技術保障。

１材料與方法

１．１材料

利用已篩選出的分化培養基［４］，以滇楊嫩莖為外植體誘導不定芽，以誘導出的不定芽作為試材。

１．２方法

１．２．１增殖培養以ＭＳ為基本培養基［５］，附加不同濃度的細胞分裂素６－ＢＡ和生長素ＮＡＡ（表１），調ｐＨ至６．０。培養溫度（２５±２） ℃、光照１ ５００～２ ０００ ｌｘ、光照時間１２ ｈ／ｄ。每處理接種２０瓶，每瓶接種４個不定芽，重復３次。接種后每隔２ ｄ觀察和記錄不定芽的生長情況。以增殖系數及試管苗生長狀況為指標，篩選出滇楊不定芽增殖培養的較優方案。１．２．２生根培養生根培養基以１／２ＭＳ為基本培養基［５］，添加３０ ｇ／Ｌ蔗糖和４．５ ｇ／Ｌ瓊脂，再加入不同濃度的ＮＡＡ（０、０．０１、０．０２、０．０５ ｍｇ／Ｌ），調ｐＨ至６．０。將增殖培養中生長健壯的試管苗切除基部的愈傷組織，接種于事先配制好的生根培養基上，培養條件同增殖培養，每處理接種２０瓶，每瓶４棵，重復３次。生根培養１周后，每隔２ ｄ觀察記錄各處理的生根數量及根的生長情況。

２結果與分析

２．１６－ＢＡ和ＮＡＡ濃度及配比對滇楊不定芽增殖的影響

增殖培養基中添加不同濃度的６－ＢＡ和ＮＡＡ，３０ ｄ后各處理不定芽的增殖情況和試管苗的生長情況見表1。６－ＢＡ和ＮＡＡ對滇楊不定芽的增殖系數和試管苗的生長有明顯影響。在實驗濃度范圍內，當６－ＢＡ濃度一定時，ＮＡＡ濃度越高，滇楊不定芽的增殖系數越小，試管苗的生長情況越差；而ＮＡＡ濃度一定時，不定芽的增殖和試管苗的生長情況也隨著６－ＢＡ濃度的增加而變差，其中６－ＢＡ濃度為０．５ ｍｇ／Ｌ時，試管苗全部黃化死亡。處理１中滇楊不定芽的增殖系數和試管苗增高幅度均高于其他處理，且試管苗莖葉嫩綠色、腋芽抽生多、叢生芽多、苗高而健壯（圖１），適合滇楊不定芽的增殖培養。

２．２ＮＡＡ濃度對滇楊試管苗的生根培養

將增殖后的試管苗轉移到添加了不同濃度ＮＡＡ的生根培養基上進行培養，１０ ｄ后觀察統計各處理試管苗的生根率、主根條數、主根長度和須根長度（表２）。在不添加激素的培養基中試管苗也可以生根，但其根相對細長、瘦弱；但ＮＡＡ濃度過高也會導致生根率下降。當ＮＡＡ的濃度為０．０２ ｍｇ／Ｌ時，所有試管苗均能生根，主根根短而粗壯，植株葉色濃綠、長勢旺盛（圖２）。

２．３滇楊試管苗的煉苗移栽

滇楊試管苗生根后，在室內開瓶放置５ ｄ左右后移栽入經消毒處理的煉苗基質（河沙與腐殖土等體積混合）中進行煉苗，幼苗生長情況良好，其成活率可達９１．１％。

３結論與討論

３．１增殖培養

在楊樹的組織培養過程中，由于基本培養基的不同和培養材料基因型的差異，需要人為調節外源激素的種類及濃度，以獲取最大的增殖系數。章林等［６］在對銀中楊進行組培研究時發現添加０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ時嫩芽條上的腋芽不斷分化與生長，具有較高的增殖率，但當６－ＢＡ與ＮＡＡ配合使用時，所有濃度的ＮＡＡ都使嫩莖的增殖率下降。而海燕等［７］在抗蟲楊的組織培養過程中添加０．１、０．５ ｍｇ／Ｌ的６－ＢＡ，其對腋芽的萌發生長影響不大。在８４Ｋ楊的組織快繁研究中發現，較高濃度的６－ＢＡ可促進腋芽生長，但６－ＢＡ濃度過高不利于抽莖，而對叢狀葉的增加有利，８４Ｋ楊腋芽增殖的最佳培養基為ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ。另外，細胞分裂素與生長素搭配使用對腋芽的增殖效果均優于其單獨使用，適宜的６－ＢＡ與ＮＡＡ濃度配比可提高出芽率［８］。而本研究在ＭＳ培養基中添加較低濃度的６－ＢＡ（０．１ ｍｇ／Ｌ）和ＮＡＡ（０．０２ ｍｇ／Ｌ），獲得了較高的增殖系數，這可能與滇楊易于無性繁殖有關［１，９］。而張春霞等［１０］以滇楊葉柄為材料成功分化出不定芽，以１／２ＭＳ為基本培養基，添加０．００１ ｍｇ／Ｌ ＴＤＺ＋０．０１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，同樣獲得了較好的增殖效果，可見不同楊樹組培中激素及其濃度的選擇不可一概而論，應根據其具體的生理生化特性來確定。

３．２生根培養

研究表明，生長素是誘導試管苗生根的重要因素，其影響酶的活性、增加原生質的透性、使代謝活動加快、ＲＮＡ合成加強，從而有利于不定根的發生和生長。不同植物、不同基因型、同一植株的不同部位、不同年齡的試驗材料分化根的能力不同［１１］。楊樹的生根培養大都采用１／２ＭＳ為基本培養基，添加一定量的ＮＡＡ、ＩＡＡ、ＩＢＡ。在山地楊的組織快繁中，１／２ＭＳ＋０．０５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ培養基中的生根率可達１００％，但添加ＩＡＡ后的生根效果較差［１２］。林元震等［１３］在甜楊的組織培養和快速繁殖研究中發現，采用改良的１／４ ＭＳ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ進行生根培養，生根率可達１００％，根數多且粗短。史紹林等［１４］在新西伯利亞銀白楊的根誘導過程中發現ＩＢＡ與ＮＡＡ配合使用效果明顯優于單獨使用，但ＮＡＡ濃度過高易產生大塊愈傷，１／２ＭＳ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．０２ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ培養基中生根率達９０％，根數多且生長健壯。本研究發現１／２ＭＳ中添加０．０２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ有利于滇楊生根，生根率可達１００％，與已報道的１／２ ＭＳ＋０．０１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ培養基最適合其生根有所差異［１０］，這可能與所用材料的內源激素水平不同等因素有關。

另外，滇楊試管苗培養１０ ｄ左右即可生根，對于這種生根培養所需時間較短的植物，應考慮打破常規的生根培養模式，研究其簡化的生根培養方法，以獲得更加理想的效果。史紹林等［１５］在山新楊試管苗的生根培養中用一定比例的蛭石、草炭土、珍珠巖替代瓊脂，用過濾自來水替代蒸餾水，混合培養基污染率很小且生根率達到９６％，這種方法有望替代傳統的生根培養，以獲得更多高質量、高成活率的植物幼苗。

參考文獻：

［１］ 何承忠，張志毅，陳寶昆，等． 滇楊遺傳改良策略初論［Ｊ］． 西部林業科學，２００４，３３（１）：４４－４８．

［２］ 何承忠，車鵬燕，周修濤，等． 滇楊基因資源及其研究概況［Ｊ］． 西南林學院學報，２０１０，３０（１）：８３－８８，９４．

［３］ 劉巖，周軍，段安安，等．楊樹組織培養的研究進展［Ｊ］． 安徽農業科學，２０１１，３９（４）：２１１６－２１１９．

［４］ 辛培堯，劉巖，段安安，等． 滇楊不同外植體分化培養研究［Ｊ］．云南農業大學學報（自然科學版），２０１１，２６（６）：８２８－８３２，８６０．

［５］ 王蒂． 植物組織培養［Ｍ］． 北京：中國農業出版社，２０１０． ２６．

［６］ 章林，陳建軍，陸志民，等． 銀中楊組培快繁技術的研究［Ｊ］． 吉林林業科技，２００３，３２（３），７－１０．

［７］ 海燕，何寧，康明輝，等． 抗蟲楊的組織培養［Ｊ］． 河南林業科技，２００４，２４（４）：１３－１４．

［８］ 張靜，林毅，蔡永萍，等． 激素水平對８４Ｋ楊組培快繁的影響［Ｊ］． 激光生物學報，２００５．１４（３）：２３３－２３７．

［９］ 韓燕，段安安，張晏，等． 滇楊扦插繁殖試驗初報［Ｊ］． 西南林學院學報，２００９，２９（２）：８６－８８．

［１０］ 張春霞，樊軍鋒，黃建，等． 滇楊的組織培養和植株再生［Ｊ］． 植物生理學通訊，２００６，４２（６）：１１３１．

［１１］ ＨＵＥＴＴＥＭＡＮ Ｃ Ａ， ＰＲＥＥＣＥ Ｊ Ｅ． Ｔｈｉｄｉａｚｕｒｏｎ： Ａ ｐｏｔｅｎｔ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ ｆｏｒ ｗｏｏｄｙ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Cｅｌｌ， Tｉｓｓｕｅ ａｎｄ Oｒｇａｎ Cｕｌｔｕｒｅ，１９９３，３３（２）：１０５－１１９．

［１２］ 汪建亞，蔣祥娥，蔡桁． 山地楊快速繁殖研究［Ｊ］． 湖北林業科技，２００４（Ｓ１）：１－７．

［１３］ 林元震，林善枝，張志毅，等． 甜楊的組織培養和快速繁殖［Ｊ］． 植物生理學通訊，２００４，４０（４）：４６３．

［１４］ 史紹林，吳長江，趙凌泉，等．新西伯利亞銀白楊組織培養基配方的篩選與應用［Ｊ］．防護林科技，２００８（６）：２５－２６．

［１５］ 史紹林，趙凌泉，徐連峰，等．淺述山新楊組培育苗的簡化培養［Ｊ］． 防護林科技，２００５（１）：９３－９４．