黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因ｃＤＮＡ克隆與生物信息學分析

蔡惠芬 陳志 羅衛星 等

摘要：選擇與羊同源性較高的牛ＲＥＲＧＬ基因組序列設計特異性引物，提取黔北麻羊脾臟總ＲＮＡ，通過ＲＴ-ＰＣＲ技術對ＲＥＲＧＬ基因進行克隆測序及序列分析。結果表明，成功克隆了黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因，其ｃＤＮＡ序列６４６ ｂｐ，ＧｅｎＢａｎｋ登錄號ＪＮ ６７１９１９，編碼２０５個氨基酸。生物信息學分析表明，黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白二級結構α－螺旋占４０．６8％，延伸鏈占１６．１８％，無規則卷曲占４３．１４％；沒有跨膜螺旋結構域且沒有糖基化位點。

關鍵詞：黔北麻羊；ＲＥＲＧＬ基因；克隆；生物信息學分析

中圖分類號：Ｓ８２７；Ｑ８１１．４文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）15－3362-04

cDNA Sequence Cloning of RERGL Gene of Qianbei Ma Goat and Bioinformatics Analysis

ＣＡＩ Ｈｕｉ-ｆｅｎ，ＣＨＥＮ Ｚｈｉ，ＬＵＯ Ｗｅｉ-ｘｉｎｇ，ＬＩＵ Ｒｕｏ-ｙｕ，ＺＨＡＮＧ Ｙｉ-ｙｕ，ＳＨＩ Ｚｈａｏ-ｙｉｎｇ

（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｌａｔｅａｕ Ｍｏｕｎｔａｉｎｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ／Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｇｏａｔ ＲＥＲＧＬ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｉｃ ｇｅｎｅ ｏｆ ｏｘ． Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ Ｑｉａｎｂｅｉ Ｍａ ｇｏａｔ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ． Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＲＥＲＧＬ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ （ＲＴ－ＰＣＲ） ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＲＥＲＧＬ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｑｉａｎｂｅｉ Ｍａ ｇｏａｔ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｌｏｎｅｄ． Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ６４６ ｂｐ， ｅｎｃｏｄｉｎｇ ２０５ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ； ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ｗａｓ ＪＮ ６７１９１９． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ the ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＲＥＲＧＬ ｗａｓ ４０．６8％ α－ｈｅｌｉｘ ＋１６．１８％ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｃｈａｉｎ＋４３．１４％ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ． Ｎｏ ｔｒａｎｓ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｌｉｘ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ Ｏ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｑｉａｎｂｅｉ Ｍａ ｇｏａｔ； ＲＥＲＧＬ ｇｅｎｅ； ｃｌｏｎｅ； ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ

ＲＥＲＧＬ基因屬于Ｒａｓ超家族基因。Ｒａｓ超家族是一類重要的功能蛋白。它們介導生長因子、細胞因子和多種細胞外信號的通路，對細胞生長、分化、存活、增殖等多種功能的調節發揮重要作用［１］。Ｒａｓ超家族在細胞信號轉導中可作為信號轉換器或分子開關，它們通過與ＧＴＰ結合（激活態）和ＧＤＰ結合（失活態）的轉換導致信號的轉導或終止［２］。ＲＥＲＧＬ與部分Ｒａｓ超家族成員的同源性可達４０％～５０％。其蛋白與ＲＥＲＧ（Ｒａｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｄ ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）蛋白功能高度相似。

黔北麻羊是貴州省三大優良山羊品種之一。其歷史悠久，具有耐粗飼、繁殖率高、產肉性能良好、膻味輕、肉鮮美可口、板皮品質優良等優點，為當地群眾所喜養［３］。羅衛星等［４］對黔北麻羊的肉用性能和肉質特征進行研究，表明黔北麻羊肉用性能和肉質性質良好，具有很好的開發價值。在分子水平上，關于黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因的研究國內外尚未見報道。本研究以黔北麻羊為研究對象，通過分子克隆技術對ＲＥＲＧＬ基因ｃＤＮＡ進行克隆后測序，并對結果進行生物信息學分析，以期為進一步開展黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因的表達調控以及與生長性狀相關分析研究提供一定的理論基礎。

１材料與方法

１．１材料

從貴州省習水縣采集成年黔北麻羊的脾臟，液氮中保存備用。

１．２試劑和載體

ＲＮＡ提取試劑盒（Ｔｒｉｚｏｌ）購自ＭＢＩ公司；ＬＢ培養基；氨芐青霉素（Ａｍｐ）（１００ ｇ／Ｌ）；１０×ＴＢＥ緩沖液；ＤＥＰＣ和瓊脂糖購自ＳＩＧＭＡ公司；ｐＭＤ１８-Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ、反轉錄試劑盒（ＤＲＲ０３７Ａ）、Ｔａｑ酶和ｄＮＴＰ購自大連ＴａＫａＲａ公司；菌種ＴＧ１、ＤＬ ２０００ Ｍａｒｋｅｒ、去離子甲酰胺、引物及其他常用試劑均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

１．３提取ＲＮＡ前的準備工作

玻璃制品用０．１ Ｍ的ＮａＯＨ浸泡過夜，用自來水反復沖洗，再用去離子水沖洗２遍，１８０ ℃烘烤６ ｈ；研缽、電泳槽等用０．１％的ＤＥＰＣ水沖洗浸泡，由于未滅活的ＤＥＰＣ對ＰＣＲ反應有影響，可用０．５ ％的ＳＤＳ處理；Ｔｉｐ頭、ＥＰ管用０．１ ％的ＤＥＰＣ水浸泡過夜，高壓滅菌使ＤＥＰＣ失活，烘干備用；提取前在超凈工作臺紫外照射１５ ｍｉｎ。

１．４總ＲＮＡ的提取及質量、濃度測定

根據ＲＮＡ提取試劑盒說明書用Ｔｒｉｚｏｌ法提取黔北麻羊脾臟總ＲＮＡ。用１％瓊脂糖凝膠檢測總ＲＮＡ的完整性，核酸蛋白測定儀測定濃度，－８０ ℃保存備用。

１．５引物設計

根據牛ＲＥＲＧＬ基因ｃＤＮＡ序列（ＮＭ＿００１１０５４７２．１）設計特異性引物ＲＥＲＧＬ-ＣＤＳ擴增羊ＲＥＲＧＬ基因的ＣＤＳ區，引物序列和退火溫度見表１。

１．６ＲＴ-ＰＣＲ擴增

按照反轉錄試劑盒操作程序進行反轉錄。引物ＧＦＩ-１的ＰＣＲ擴增體系：反轉錄產物２．５ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ Ｐｌｕｓ）２ μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０ μＬ，上下游引物各１ μＬ，Ｔａｑ酶（５ Ｕ／μＬ）０．４ μＬ，加去離子水至總體積為２０ μＬ。擴增程序：９５ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，５５ ℃退火４０ ｓ，７２ ℃延伸６０ ｓ，３５個循環；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ，４ ℃ 保存，１％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

１．７克隆及重組子篩選與鑒定

ＰＣＲ產物經電泳檢測后，按ＤＮＡ膠回收試劑盒說明進行膠回收，用ｐＭＤｌ８-Ｔ載體連接ＰＣＲ純化產物，常溫過夜后轉化連接產物到大腸桿菌ＴＧ１感受態細胞，均勻接種于含氨芐青霉素的ＬＢ瓊脂糖平板中，３７ ℃培養１２～１６ ｈ，挑取單個菌落，接種于１ ｍＬ含１００ ｍｇ／Ｌ氨芐青霉素的ＬＢ液體培養基中，３７ ℃ ２２０ ｒ／ｍｉｎ培養１０ ｈ。取菌液做ＰＣＲ進行陽性重組子鑒定。陽性菌液送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

１．８序列分析

測序結果用ＤＮＡＭＡＮ ４．０軟件進行拼接，采用ＤＮＡＳｔａｒ、ＣＢＳ在線蛋白分析程序（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/）和ＥｘＰＡＳｙ在線蛋白質分析軟件（ｈｔｔｐ：//ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ/ｔｏｏｌｓ）進行生物信息學分析。

２結果與分析

２．１黔北麻羊脾臟總ＲＮＡ質量檢測

ＲＮＡ模板的完整性是獲得全長ｃＤＮＡ及ＲＴ-ＰＣＲ擴增成功的基礎，用１％的瓊脂糖凝膠電泳對所提取黔北麻羊脾臟組織總ＲＮＡ進行檢測，結果見圖１，可見總ＲＮＡ的２８ Ｓ和１８ Ｓ條帶清晰，無降解。用核酸蛋白測定儀測定，其ＯＤ２６０／ＯＤ２８０均在１．８～２．０，表明所提取的總ＲＮＡ中蛋白質和其他雜質污染較少，純度較高，符合反轉錄的要求。

２．２ＲＴ-ＰＣＲ的擴增結果及重組子鑒定

經ＲＴ-ＰＣＲ擴增，對產物用１％瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見擴增片段與預期片段（６４６ ｂｐ）大小相符（圖２）。將挑選好的單克隆菌落搖菌培養后，用ＰＣＲ法鑒定陽性重組子，可見擴增片段與預期片段大小相符，經克隆測序獲得序列６４６ ｂｐ，初步的驗證克隆成功。

２．３ＲＥＲＧＬ基因ｃＤＮＡ序列分析

利用ＤＮＡＭＡＮＮ ４．０對黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因測序結果進行拼接連接得到序列片段長度６４６ ｂｐ，與預期片段大小相符，包含了ＲＥＲＧＬ基因全編碼區序列（ＣＤＳ）（包含起始密碼子ＡＴＧ和終止密碼子ＴＧＡ）并提交ＧｅｎＢａｎｋ，獲得ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＪＮ ６７１９１９。其ｃＤＮＡ編碼２０５個氨基酸。用ＤＮＡＭＡＮ ４．０對黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因分析可知，其堿基組成Ａ＋Ｔ＝５８．３７％，Ｃ＋Ｇ＝４１．６３％。

２．４ＲＥＲＧＬ基因蛋白的二級結構預測

分別應用ＥxＰＡＳy服務器上的ＳＯＰＭＡ［５］、ＧＯＲ［６］、ＨＮＮ［７］方法預測ＲＥＲＧＬ基因蛋白的二級結構。結果表明，３種方法對黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白的二級結構預測無顯著性差異，均提示蛋白二級結構中α-螺旋占４０．６8％，延伸鏈占１６．１８％，無規則卷曲占４３．１４％，無β-轉角（圖３）。ＲＥＲＧＬ基因在脊椎動物之間是高度保守的一個基因，其氨基酸序列有家族特征［９，１０］。

２．５ＲＥＲＧＬ基因蛋白的跨膜螺旋特征

采用ＥｘＰＡＳｙ在線蛋白質分析軟件（ｈｔｔｐ：//ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ）的ＴＭｐｒｅｄ程序對黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白的跨膜螺旋進行預測，結果見圖４。按照跨膜拓撲學分析模型的分析結果，只有當分值大于５００時才被認為具有跨膜螺旋，預測顯示黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白的氨基酸序列沒有明顯的跨膜螺旋。

２．６ＲＥＲＧＬ基因蛋白的糖基化位點預測

采用ＮｅｔＯＧｌｙｃ ３．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ／）預測黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白的糖基化位點，結果表明黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白沒有糖基化位點（圖５）。

３小結與討論

３．１ＲＥＲＧＬ基因克隆

基因是細胞內染色體上具有遺傳效應的ＤＮＡ分子片段，高等真核生物基因組由成千上萬個基因組成。目前人、雞、斑馬魚、大鼠、小鼠等動物的全基因組已被測定，并已分離鑒定出大量的功能結構基因，有一些基因已應用于動物育種［８-１０］。但是，仍還有大量的基因尚未被分離鑒定。ＲＥＲＧＬ基因編碼蛋白是Ｒａｓ超家族一類重要的功能蛋白,在ＧｅｎＢａｎｋ數據庫中，還未見羊的ＲＥＲＧＬ基因序列。本研究利用同為反芻動物的牛ＲＥＲＧＬ基因的ｍＲＮＡ序列設計１對特異性擴增引物，首次成功克隆出羊的ＲＥＲＧＬ基因序列，其片段大小為６４６ ｂｐ，ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＪＮ ６７１９１９，進一步說明采用序列的高度同源性設計ＰＣＲ引物進行基因克隆是可行的。

３．２黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白的結構與功能預測

蛋白質的生物學功能在很大程度上取決于其空間結構，蛋白質構象多樣性導致了不同的生物學功能。蛋白質分子只有處于特定的三維空間結構情況下才能獲得它特定的生物活性，三維空間結構稍有破壞，就很可能會導致蛋白質生物活性的降低甚至喪失。分析蛋白質結構、功能及其關系是蛋白質組學計劃中的一個重要組成部分［１１-１３］。研究蛋白質結構有助于了解蛋白質的生物功能，這對認識蛋白質與蛋白質或與ＤＮＡ以及與ＲＮＡ之間的相互作用具有非常重要的生物學意義。對于未知功能或者新發現的蛋白質分子，利用ＥｘPASｙ等系統軟件預測其功能和結構可提供理論性的參考，并對功能確認的生物學實驗有重要指導作用［１４-１６］。通過分析蛋白質的結構，確認功能單位或者結構域，可以為遺傳操作提供方向，為設計新的蛋白質或改造已有蛋白質提供可靠的依據。

通過跨膜螺旋結構和信號肽分析可以推測基因在細胞中的定位；而潛在功能位點的分析可以在對新基因及其編碼蛋白信息一無所知的情況下初步推測基因的功能［１４］。研究結果顯示，黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白沒有跨膜螺旋結構域，且分子不包含信號肽序列，表明ＲＥＲＧＬ基因在細胞中起作用。

糖基化是在酶的控制下，蛋白質或脂質附加上糖類的過程。蛋白質經過糖基化作用之后可形成糖蛋白。蛋白質的糖基化，也叫美拉德反應，是在蛋白質基團特別是賴氨酸殘基上加上多糖，可以改善蛋白質的很多性質，比如提高凝膠性、乳化性、水合性等，擴寬蛋白質的應用領域和范圍［１７］。研究結果揭示黔北麻羊ＲＥＲＧＬ沒有蛋白糖基化位點。

此次實驗在黔北麻羊上成功克隆出ＲＥＲＧＬ基因序列并進行序列分析，為今后開展山羊ＲＥＲＧＬ基因表達、載體構建及轉基因研究提供了基礎資料。但其理化性質參數、跨膜肽段及結構是否是預測的理論結果需進一步實驗證實。在沒有任何信息可參考的前提下，本研究結果也可起到很好的參考作用，對正確認識蛋白質結構和功能具有啟示作用。

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