甲基苯并唑衍生物與ＨＩＶ－１逆轉錄酶相互作用的分子模擬研究

胡建平 唐典勇 孫國峰 等

摘要：對ＨＩＶ－１逆轉錄酶（ＲＴ）與二氟甲基苯并唑甲基嘧啶硫醚（ＤＦＭＭＴ）及甲基苯并唑甲基嘧啶硫醚（ＭＭＴ）兩個甲基苯并唑衍生物的復合物進行了分子動力學模擬，從分子整體、結合模式優化和水分子作用３個角度詳細分析了甲基苯并唑衍生物與ＨＩＶ－１ ＲＴ相互識別的機制。結果表明，ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ在ＲＴ中的結合位點幾乎一致；但ＤＦＭＭＴ與ＲＴ的π－π堆積作用更強。另外，ＲＴ的ＤＦＭＭＴ結合口袋中有３個穩定的水分子存在，而ＭＭＴ結合則沒有水分子參與。３個水分子的協同使得ＤＦＭＭＴ與ＲＴ的相互作用強于ＭＭＴ，這可能是雙氟促進抑制活性的作用機制之一。

關鍵詞：甲基苯并唑衍生物；ＨＩＶ－１逆轉錄酶；分子動力學模擬；雙氟；抑制活性

中圖分類號：R512.91；R978.7 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）15－3358-04

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ＨＩＶ－１ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ

ＨＵ Ｊｉａｎ－ｐｉｎｇ１，ＴANG Ｄｉａｎ－ｙｏｎｇ１，ＳUN Ｇｕｏ－ｆｅｎｇ１，CHENG Ｙｉｎｇ1，CHANG Ｓｈａｎ２

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｅｓｈａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌｅｓｈａｎ ６１４００４， Ｓｉｃｈｕａｎ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｗｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｆｏｒ ＨＩＶ－１ ＲＴ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ ｄｅｒｅｖａｔｉｖｅｓ， ｄｉｆｌｕｏｒｏ－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ （ＤＦＭＭＴ） ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ（ＭＭＴ）． Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＨＩＶ－１ ＲＴ ａｎｄ ｔｗｏ ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ ｄｅｒｅｖａｔｉｖｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔａｉｌｅｄｌｙ ａｎａｌｙｚｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｓ ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＤＦＭＭＴ ａｎｄ ＲＴ ｗａｓ ａｌｍｏｓｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ＭＭＴ， ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ π－π ｓｔａｃｋｉｎｇ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＦＭＭＴ ｗｉｔｈ ＲＴ ｗａｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｏｆ ＭＭＴ． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｔｈｒｅｅ ｓｔａｂｌｙ ｗａｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ ｏｆ ＲＴ ｆｏｒ ＤＦＭＭＴ， ｗｈｉｌｅ ｎｏ ｗａｔｅｒ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＲＴ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ＭＭＴ． Ｔｈｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｗａｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｍａｄｅ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＤＦＭＭＴ ａｎｄ ＲＴ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ＭＭＴ， ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｂｅ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｄｉｆｌｕｏｒｉｎ ｆａｖｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ； ＨＩＶ－１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ； ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ； ｄｉｆｌｕｏｒｉｎ； ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ

ＨＩＶ－１逆轉錄酶（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ， ＲＴ）將融入到宿主細胞中的單鏈病毒ＤＮＡ催化合成雙鏈病毒前ＤＮＡ，是ＨＩＶ生命周期中必不可少的一個步驟，也是抗ＨＩＶ藥物的靶點。非核苷類逆轉錄酶抑制劑（Ｎｏｎ－ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＮＮＲＴＩｓ）能競爭性抑制ＨＩＶ－１ ＲＴ，阻礙病毒前ＤＮＡ的合成，在治療艾滋病中起著重要的作用［１－４］。二氟甲基苯并唑甲基嘧啶硫醚（Ｄｉｆｌｕｏｒｏ－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ，ＤＦＭＭＴ）（圖１Ａ）是一種非常有潛力的ＮＮＲＴＩｓ先導化合物［５］，研究表明，甲基苯并唑官能團對于維持該分子的抑制活性必不可少，而雙氟取代對于其維持高活性十分關鍵，與之相對的的甲基苯并唑甲基嘧啶硫醚（Ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ，ＭＭＴ）（圖１Ｂ）的活性則較低［６］。盡管之前有一系列對ＤＦＭＭＴ及ＭＭＴ的改造研究，但是水分子在這些甲基苯并唑衍生物發揮抑制作用時的角色，以及ＤＦＭＭＴ的抑制劑活性遠高于ＭＭＴ的原因尚未被闡明，本研究就這些問題進行探討，為ＮＮＲＴＩｓ的開發提供參考。

１模擬方法

以ＨＩＶ－１ ＲＴ和ＤＦＭＭＴ的復合物晶體結構［５］為參考（ＰＤＢ代碼：２ＫＹＮ）搭建分子動力學（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ，ＭＤ）模擬所需的體系結構。由于ＲＴ分子Ｂ鏈與ＤＦＭＭＴ沒有相互作用，故截去Ｂ鏈；又因為Ａ鏈分子過于狹長，為了節約計算時間，在不影響計算精度的前提下以ＤＦＭＭＴ質心為中心保留２．５ ｎｍ以內的ＲＴ分子結構，保留的Ａ鏈區域為Ａｓｎ８１－Ｇｌｕ３９６。將截取的Ａ鏈Ａｓｎ８１－Ｇｌｕ３９６和ＤＦＭＭＴ晶體結構定義為ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ，另外將ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ中的兩個氟原子用氫原子替代，得到的體系定義為ＲＴ＿ＭＭＴ。

ＭＤ模擬采用Ａｍｂｅｒ程序［７］和Ａｍｂｅｒ力場［８］，該力場中蛋白的力場參數數據均基于實驗值擬合。模擬溫度為３００ Ｋ，溶劑采用ＴＩＰ３Ｐ水模型［９］，ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ和ＲＴ＿ＭＭＴ體系在外圍加上１．２ ｎｍ的水分子層后，水分子總數均為２２ ３５１個，總原子數為７２ ２９８個。ＭＤ模擬之前，對體系分別進行兩次能量優化，首先約束溶質［約束力常數為４．１８×１０３ ｋＪ／（ｍｏｌ·ｎｍ）］，用最陡下降法優化５ ０００步，再用共軛梯度法優化５ ０００步；去約束后再進行５ ０００步最陡下降法優化和５ ０００步共軛梯度法優化，收斂條件為能量梯度小于４．１８×１０－４ ｋＪ／（ｍｏｌ·ｎｍ）。ＭＤ模擬分為兩步，先進行４００ ｐｓ的約束溶質分子ＭＤ模擬［約束力常數為４．１８×１０３ ｋＪ／（ｍｏｌ·ｎｍ）］；溫度從０ Ｋ逐步升高到３００ Ｋ，接著進行４ ０００ ｐｓ的無約束恒溫ＭＤ模擬。用ＶＭＤ實時跟蹤模擬過程中的體系構象，采用ＳＨＡＫＥ算法［１０］約束鍵長，ＭＤ模擬的積分步長為２ ｆｓ，非鍵相互作用的截斷半徑設為１．２ ｎｍ，每隔２ ｐｓ采樣１次，每個體系的ＭＤ模擬均收集２ ２００個構象。

２結果與分析

２．１體系整體的模擬分析

首先計算體系ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ和ＲＴ＿ＭＭＴ勢能隨時間的變化，兩個體系的勢能分別為（－２２０ １１０±６ ５２３） ｋＪ／ｍｏｌ和（－２２０ ０１１±２ ５８６） ｋＪ／ｍｏｌ，波動范圍均小于０．５％，可見兩個體系在整個模擬過程中平穩可靠。圖２給出了ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ和ＲＴ＿ＭＭＴ體系整體Ｃα原子以及ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ小分子的方均根偏差（Ｒｏｏｔ ｍｅａｎ ｓｑｕａｒｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ，ＲＭＳＤ）隨時間的變化。從圖２（Ａ）可知，ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ和ＲＴ＿ＭＭＴ復合物體系在２．４ ｎｓ后基本達到平衡，RMSD分別為（０．１７９±０．０１２） ｎｍ和（０．２１８±０．０１３） ｎｍ。可見體系ＲＴ＿ＭＭＴ的波動性比ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ稍大，這可能是由于ＤＦＭＭＴ中兩個氟原子突變成ＭＭＴ中兩個氫原子，結合口袋區電荷環境的變化導致整體運動性更強。分析ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ抑制劑的ＲＭＳＤ發現，ＤＦＭＭＴ的運動性稍強于ＭＭＴ，但兩個抑制劑小分子與ＲＴ均結合穩定，運動性都不大，ＲＭＳＤ均維持在０．１２ ｎｍ以下。

方均根漲落（Ｒｏｏｔ ｍｅａｎ ｓｑｕａｒｅ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ， ＲＭＳＦ）可用來反映體系在整個模擬過程中相對于平均結構所發生的構象變化，較大的ＲＭＳＦ說明對應的殘基柔性大［１１］。圖３給出了體系ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ和ＲＴ＿ＭＭＴ的Ｃα原子的ＲＭＳＦ分布及相關性。從圖３Ａ可知，體系ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ和ＲＴ＿ＭＭＴ的ＲＭＳＦ分布非常相近，柔性較大的區域主要分布在Ｔｈｒ１３１－Ｇｌｙ１５５和Ｃｙｓ２８０－Ｇｌｕ３００幾個向外伸展開來的ｌｏｏｐ區。為了精細分析兩個體系柔性的差別，圖３Ｂ給出了兩個體系的ＲＭＳＦ的相關性結果，其相關系數達到０．９５，這進一步表明ＲＴ無論與ＭＭＴ還是與ＤＦＭＭＴ結合，蛋白質的運動性沒有發生很大改變。

２．２優化后的結合模式

為了分析ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ抑制劑在水溶液中的運動性差別，并分析這種運動性與前者抑制活性更強的相關性。基于圖２Ａ信息，獲得并疊落了兩個體系最后２ ｎｓ的軌跡（２．４～４．４ ｎｓ，共１ ０００個構象）的平均結構。疊落結果表明，ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ吻合較好，分子中心有微弱的平移。為了詳細分析兩個抑制劑分子在ＲＴ中的結合模式，給出了體系中ＲＴ與ＤＦＭＭＴ及ＭＭＴ距離小于０．４ ｎｍ的接觸殘基［１２］。ＤＦＭＭＴ有１５個接觸殘基，具體為Ｐｒｏ９５、Ｌｅｕ１００、 Ｌｙｓ１０１、 Ｌｙｓ１０３、 Ｖａｌ１０６、 Ｖａｌ１７９、 Ｉｌｅ１８０、Ｔｙｒ１８１、 Ｔｙｒ１８８、 Ｖａｌ１８９、 Ｇｌｙ１９０、 Ｔｒｐ２２９、 Ｌｅｕ２３４、Ｈｉｓ２３５和Ｔｙｒ３１８。ＭＭＴ的接觸殘基也是１５個，與ＤＦＭＭＴ只有一個不同，具體是用Lｅｕ２２７代替了Ｉｌｅ１８０。相似率如此高的接觸殘基表明，雙氟的有無并沒有導致這類化合物在ＲＴ中結合位點發生太大變化。值得一提的是，結合圖３Ａ的ＲＭＳＦ分析來看，上述接觸殘基的柔性均較低，這也印證了這些殘基參與結合抑制劑小分子，進而表現出較低的柔性。

通過計算ＤＦＭＭＴ及ＭＭＴ與ＲＴ之間的氫鍵，發現沒有任何氫鍵的存在，這表明，受體—配體之間的識別還有其他的作用維系。ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ有５個相同的含有芳香側鏈的接觸殘基，即Ｐｒｏ９５、Ｔｙｒ１８１、Ｔｙｒ１８８、Ｔｒｐ２２９和Ｔｙｒ３１８，加上ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ均有芳香基團，它們之間應有較強的π－π堆積作用。圖４給出了ＤＦＭＭＴ及ＭＭＴ在ＲＴ中的優化后的π－π相互作用情況，分別用ｂｌａｃｋ－ｒｉｂｂｏｎ和ｂｌａｃｋ－ｓｔｉｃｋ模型表示ＲＴ大分子和抑制劑ＤＦＭＭＴ及ＭＭＴ小分子。從圖４可知，雙氟取代使得芳香接觸殘基Ｔｙｒ１８８取向有較大的變化，ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ中的π－π堆積作用比ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ稍強，這可能與ＤＦＭＭＴ抑制活性強于ＭＭＴ有一定的關聯性。

２．３水的介導作用

為了分析溶劑水是否參與了ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ與ＲＴ之間的識別，以ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ分子質心為中心，分析一定ｃｕｔｏｆｆ半徑內的水分子的個數。圖５Ａ統計了ＭＭＴ和ＤＦＭＭＴ一定ｃｕｔｏｆｆ范圍內水分子個數。從圖中可以看出，在ｃｕｔｏｆｆ為０．４ ｎｍ時，ＤＦＭＭＴ周圍僅有１個水分子，在０．４５～０．５５ ｎｍ時，新加入了２個水分子。從０．６ ｎｍ之后，ＤＦＭＭＴ體系基本維持著比ＭＭＴ多２～３個水分子的情況。可以推測，兩個氟原子有利于口袋水的進入。之前的報道顯示，水在甲基苯并唑衍生物與ＲＴ間起著重要的介導作用。此次研究的結果顯示，水沒有參與ＭＭＴ與ＲＴ的相互識別，這可能是ＭＭＴ抑制活性較弱的主要原因。圖５Ｂ給出了前述的３個口袋水與ＲＴ及ＤＦＭＭＴ之間的相互作用和以３個口袋水氧原子為中心，半徑０．５ ｎｍ以內的所有殘基，以及水分子與其周圍的接觸殘基的距離。

３小結與討論

基于ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ和ＲＴ＿ＭＭＴ兩個復合物的長時間含水ＭＤ模擬軌跡，通過兩個體系的ＲＭＳＦ計算值的相關性分析驗證了分子模擬的可靠性。長時間ＭＤ優化給出了水溶液中ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ及ＲＴ＿ＭＭＴ復合物結構，通過分析兩個體系中抑制劑周圍的π－π堆積作用發現，ＤＦＭＭＴ周圍的π－π堆積作用強于ＭＭＴ。對兩個體系中抑制劑口袋中水的分析結果表明，與ＭＭＴ相比，含有雙氟的ＤＦＭＭＴ使得口袋親水性更高，３個水分子的參與使得ＤＦＭＭＴ與ＲＴ的結合能力強于ＭＭＴ，這可能是ＤＦＭＭＴ抑制性比ＭＭＴ強的主要原因。模擬結果對于基于ＲＴ結構甲基苯并唑衍生物抑制劑設計的研究有一定的指導意義。

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