河北道地藥材紫菀中總黃酮的熒光分析

馮俊霞 陸敏 郭瑞霞 戚秀菊

摘要：以槲皮素為標準品，用熒光分光光度法測定中藥材紫菀（Ａｓｔｅｒ ｔａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ．ｆ．）中總黃酮含量，該方法的檢出限為２．５１×１０－７ ｇ／Ｌ，線性回歸方程為ｙ＝５３１．８４０ ４８ｘ－３．５４４ ４８，相關系數Ｒ２＝０．９９９ ０３，線性范圍為６．７×１０－６～６．０×１０－４ ｇ／Ｌ；紫菀中總黃酮的平均含量為４．８９６×１０－３ ｇ／Ｌ，樣品測定的ＲＳＤ為０．９２％，平均回收率為９３．１９％。該方法操作簡便、準確度高，可以為中藥材紫菀質量控制提供參考。

關鍵詞：紫菀（Ａｓｔｅｒ ｔａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ．ｆ．）；總黃酮；熒光分光光度法

中圖分類號：Ｏ６５７．３ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）15－3323-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖａｎｏｉｄ ｉｎ Ｒａｄｉｘ Ａｓｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｈｅｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｂｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ

ＦＥＮＧ Ｊｕｎ－ｘｉａa，ＬＵ Ｍｉｎa，ＧUO Ｒｕｉ－ｘｉａa，ＱＩ Ｘｉｕ－ｊｕb

（Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， a．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； b．Ａｄｍｉｎｓｔａｔｉｖｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｓｔａｔｅ Ｏｗｎｅｄ Ａｓｓｅｔｓ， Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ ０５００３５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖａｎｏｉｄ ｉｎ Aｓｔｅｒ ｔａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ．ｆ． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ２．５１×１０－７ ｇ／Ｌ， ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｗａｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ６．７×１０－６～６.0×１０－４ ｇ／Ｌ， ａｎｄ ｔｈｅ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｙ＝５３１．８４０ ４８ｘ－３．５４４ ４８， and ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｒ２ was ０．９９９ ０３． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖａｎｏｉｄ ｉｎ A. ｔａｔａｒｉｃｕｓ ｗａｓ ４．８９６×１０－３ ｇ／Ｌ， and ＲＳＤ was ０．９２％， ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９３．１９％． Ｉｔ ｉｓ a ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖａｎｏｉｄ ｉｎ A. ｔａｔａｒｉｃｕｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒimetry． Ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔ A. ｔａｔａｒｉｃｕｓ.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒａｄｉｘ Ａｓｔｅｒ（Ａｓｔｅｒ ｔａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ．ｆ．）； ｔｏｔａｌ ｆｌａｖａｎｏｉｄ； ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ

紫菀是菊科多年生草本植物紫菀（Ａｓｔｅｒ ｔａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ．ｆ．）的干燥根及莖，具有潤肺下氣、祛痰止咳之功效［１，２］，是河北省的道地藥材之一［３］。黃酮類化合物是其主要藥理活性成分，主要有槲皮素、山萘酚等［１，２，４］。本試驗以槲皮素作為標準品，利用熒光分析法對紫菀中總黃酮含量進行了測定，為中藥材紫菀的質量控制提供參考。

１材料與方法

１．１材料與試劑

紫菀，２０１１年１月購于石家莊新興藥房，由石家莊學院馮海燕副教授鑒定為菊科植物紫菀（Ａｓｔｅｒ ｔａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ．ｆ．）的干燥根及莖，該藥材在６０ ℃真空干燥５ ｈ，取出粉碎，置干燥器中備用。槲皮素對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，經１２０ ℃真空干燥４ ｈ，取出置于干燥器中冷卻備用。Ａｌ（ＮＯ３）３·９Ｈ２Ｏ容易潮解，使用前５０ ℃真空干燥６ ｈ。綠原酸由中國藥品生物制品檢定所提供。所用試劑均為分析純。

１．２主要儀器

Ｆ－４５００型熒光分光光度計（日本日立公司）；ＫＱ３２００ＤＥ型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；雷磁ＰＨＳ－３ＣＰＨ計、ＦＡ２２０４Ｂ電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；ＤＺ－１ＢＣ真空干燥箱、ＦＷ１００高速萬能粉碎機、ＤＫ－９８－１型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

１．３試驗方法

１．３．１樣品溶液的制備稱取粉碎的紫菀樣品５．００ ｇ，置于２５０ ｍＬ三角瓶中，加入１５０ ｍＬ ６０％乙醇，浸泡５ ｈ，用超聲波破碎提取，參照文獻［５］的方法并有所改進：超聲溫度為４０ ℃，料液比１∶３０（質量體積比），超聲時間為４０ ｍｉｎ，連續提取３次；提取完畢后，真空抽濾，合并３次濾液，６０％乙醇定容至２５０ ｍＬ，待測。

１．３．２槲皮素標準溶液的制備準確稱取槲皮素對照品０．００１ ５ ｇ，用７０％乙醇溶解，定容至１００ ｍＬ容量瓶中，配成濃度為１．５×１０－２ ｇ／Ｌ的標準溶液。準確吸取１ ｍＬ １．５９８ ｇ／Ｌ Ａｌ（ＮO３）３溶液，分別置于６只２５ ｍＬ容量瓶中，各容量瓶中依次加入槲皮素標準溶液０、０．２、０．４、０．６、０．８和１．０ ｍＬ，再加入２ ｍＬ ＨＡc－ＮａＡc緩沖溶液（ｐＨ ２．６５），用７０％的乙醇定容搖勻，室溫下靜置３０ ｍｉｎ，待測。

１．３．３測定在激發光譜通帶２．５ ｎｍ、發射光譜通帶５ ｎｍ、激發波長λｅｘ＝４３６ ｎｍ、發射波長λｅｍ＝４８６ ｎｍ的條件下測定系列槲皮素標準溶液的熒光強度，以熒光強度對相應的濃度作圖，繪制標準曲線，得到回歸方程，然后在相同條件下測定紫菀樣品溶液中總黃酮的熒光強度，利用回歸方程計算其含量。

２結果與分析

２．１熒光化合物的激發及發射光譜

按照試驗方法，配制濃度為３×１０－４ ｇ／Ｌ的槲皮素標準溶液，在選定的合適激發光譜通帶２．５ ｎｍ，發射光譜通帶５ ｎｍ條件下，對其激發及發射光譜進行掃描，所得激發及發射光譜見圖１。

２．２測定條件的選擇

２．２．１溶劑的確定準確吸取１ ｍＬ １．５９８ ｇ／Ｌ Ａｌ（ＮＯ３）３溶液，加入１ ｍＬ １．５×１０－２ ｇ／Ｌ槲皮素標準溶液，２ ｍＬ ＨＡc－ＮａＡc緩沖溶液（ｐＨ ２．６５），１ ｍＬ １％ β－ＣＤ，分別用５０％、６０％、７０％、８０％、９０％的乙醇定容至２５ ｍＬ，搖勻，室溫下靜置６０ ｍｉｎ，在發射波長４８６ ｎｍ處測定熒光強度。從圖２可知，在４８６ ｎｍ處槲皮素－鋁配合物的熒光強度隨著乙醇濃度的增加而增加，但當乙醇濃度達到８０％時，最大峰位置明顯向長波方向移動。從測定結果及節約溶劑的角度出發，確定７０％乙醇為測定溶劑。

２．２．２ｐＨ的確定按照上述方法，用７０％乙醇作溶劑，分別在ｐＨ ２．６５、３．３６、４．３７、５．１９時測定熒光強度。從測定結果（圖３）可知，隨著ｐＨ的升高，槲皮素－鋁配合物的熒光強度迅速降低，ｐＨ ２．６５時最大熒光強度為４０１．７，至ｐＨ ５．１９時已經降低為６２．7；且最大峰位置不斷向長波方向移動，至ｐＨ ５．１９時，已經由ｐＨ ２．６５時的４８６ ｎｍ移動至５３１．４ ｎｍ。根據以上測定結果，在本試驗中加入２ ｍＬ ＨＡc－ＮａＡc緩沖溶液（ｐＨ ２．６５）。

２．２．３表面活性劑的確定選擇了不加表面活性劑和加入３種不同的表面活性劑（ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、β－ＣＤ，濃度均為１％）來比較表面活性劑對槲皮素－鋁配合物熒光強度的影響。從圖４可知，加入表面活性劑并不改變峰的位置，ＳＤＳ對熒光有熄滅作用，β－ＣＤ和ＣＴＡＢ沒有明顯的增敏作用，因此在試驗中選擇不添加表面活性劑。

２．２．４溫度的確定在上述選定的溶劑、ｐＨ條件下改變反應溫度，分別在１３、３３、５３和７３ ℃下測定體系的熒光強度。從圖５可以得出，溫度能夠顯著影響體系的熒光強度，隨溫度的升高，體系的熒光強度顯著降低，室溫時最大熒光強度為４２６，而在７３ ℃時僅為２０３．２。溫度對峰位置不產生影響，因此選擇在室溫下進行測定。

２．２．５反應時間的確定改變反應時間，在２０、４０、６０、８０和１００ ｍｉｎ ５個時間點測定槲皮素對照品的熒光強度，結果如圖６所示，溶液的熒光強度在２０～４０ ｍｉｎ內基本保持穩定且數值最高，在４０ ｍｉｎ之后，熒光強度呈緩慢下降趨勢，因此，選擇３０ ｍｉｎ為最佳測定時間。

２．２．６金屬離子和綠原酸的干擾測定結果一些金屬離子和有機酸對鋁離子和槲皮素的結合存在配位競爭干擾，在上述選定的試驗條件下，考察了常見的金屬離子Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋、Ｆｅ３＋和綠原酸對試驗的影響。從圖７可知，Ｃａ２＋和Ｍｇ２＋對測定沒有干擾，Ｃｕ２＋使測定結果偏低，而Ｆｅ３＋的干擾最大，嚴重影響試驗結果；綠原酸使測定結果偏高。

２．３標準曲線的繪制

在選定的最佳試驗條件下，測得在６．７×１０－６～６．０×１０－４ ｇ／Ｌ范圍內槲皮素濃度與其熒光強度呈良好的線性關系。其線性回歸方程為ｙ＝５３１．８４０ ４８ｘ－３．５４４ ４８，相關系數Ｒ２＝０．９９９ ０３。通過測定試劑空白溶液１２次，依據公式ＣＬＯＤ＝３Ｓ／Ｋ（Ｓ為空白溶液的標準偏差，Ｋ為工作曲線斜率）計算方法檢出限為２．５１×１０－７ ｇ／Ｌ。標準曲線見圖８。

２．４樣品測定及精密度

按上述試驗方法測定了紫菀中總黃酮的含量，并對樣品溶液進行平行測定（ｎ＝５），結果見表１，方法精密度良好。

２．５加標回收率

為了驗證試驗方法的準確性，做了加標回收試驗，結果見表２，方法準確性良好。

３小結與討論

利用熒光法測定中藥材紫菀中的總黃酮含量，結果準確、精密度高；而且該方法操作簡便，樣品使用量少，測定成本較中藥材黃酮含量測定常用的高效液相色譜法低，是一種比較實用的方法。

熒光分析受到許多因素的限制（ｐＨ值、溫度、溶劑濃度等），所以該方法必須是在特定的條件下使用。中藥材成分比較復雜，成分之間相互作用，對熒光分析結果可能產生影響，因此應加強提取過程研究。

參考文獻：

［１］ 侯海燕，陳立，董俊興．紫菀化學成分及藥理活性研究進展［Ｊ］．中國藥學雜志，２００６，４１（４）：１６１－１６３．

［２］ 庫爾班江，歐陽艷，努爾買買提． 紫菀屬植物化學成分及藥理作用研究進展［Ｊ］．中國野生植物資源，２０１０，２９（２）：１－４．

［３］ 范麗芳，王巧，張蘭桐，等． 河北道地藥材紫菀的指紋圖譜研究［Ｊ］．中草藥，２００７，３８（１０）：１５６６－１５７０．

［４］ 田亞平，景秀娟，徐磊，等． ＨＰＬＣ法測定紫菀中阿魏酸、槲皮素和山奈酚［Ｊ］．中草藥，２００８，３９（６）：９２６－９２８．

［５］ 鐘方麗，王曉林，張義蘭，等． 超聲波輔助提取紫菀總黃酮的工藝研究［Ｊ］．安徽農業科學，２０１０，３８（１６）：８６６２－８６６４．