樹莓果實維生素Ｃ積累與其合成氧化酶的關系

張丙秀 高媛 陳倩 高慶玉

摘要：對４個品種的樹莓（Ｒｕｂｕｓ ｉｄａｅｕｓ）果實生長過程中還原型維生素Ｃ（ＡｓＡ）、氧化型維生素Ｃ（ＤＨＡ）及總維生素Ｃ含量進行了分析，并對Ｌ－半乳糖酸－１，４－內酯脫氫酶（ＧａｌＬＤＨ）、抗壞血酸氧化酶（ＡＡＯ）及抗壞血酸過氧化物酶（ＡＰＸ）３種酶的活性進行了測定分析。結果顯示，ＡｓＡ和總維生素Ｃ含量隨著果實的成熟而逐漸上升。４個品種中ＧａｌＬＤＨ活性與ＡsＡ積累之間均呈顯著正相關。ＡＡＯ和ＡＰＸ活性與ＡｓＡ含量相關性不顯著，而ＡＰＸ活性與ＤＨＡ含量呈顯著正相關。說明不同樹莓品種間維生素Ｃ含量存在差異的原因與其ＧａｌＬＤＨ及ＡＰＸ活性有關。

關鍵詞：樹莓；維生素Ｃ；ＧａｌＬＤＨ；ＡＡＯ；ＡＰＸ

中圖分類號：Ｓ６６３；Ｑ５６４；Ｑ５５９文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）15－3243-03

Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ｏｒ Ｏｘｉｄａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Rubis idaeus Fruit

ＺＨＡＮＧ Ｂｉｎｇ－ｘｉｕ，ＧＡＯ Ｙｕａｎ，ＣＨＥＮ Ｑｉａｎ，ＧＡＯ Ｑｉｎｇ－ｙｕ

（Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００３０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： The aｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ （ＡｓＡ）， Ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ （ＤＨＡ） ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｆｏｕｒ ｒａｓｐｂｅｒｒｙ （Ｒｕｂｕｓ ｉｄａｅｕｓ） ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｆｒｕｉｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ； ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｌ－ｇａｌａｃｔｏｎｏ－１，４－ｌａｃｔｏｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＧａｌＬＤＨ）， ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ（ＡＡＯ） ａｎｄ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＡＰＸ） ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｍｅａｓｕｒｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＡｓＡ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｃｏｎｔｉｎｕａｌｌｙ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． ＧａｌＬＤＨ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＡＳＡ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ． ＡＡＯ ａｎｄ ＡＰＸ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ＡｓＡ； ｂｕｔ ＡＰＸ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＤＨＡ ｃｏｎｔｅｎｔ， which ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｒａｓｐｂｅｒｒｙ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ was ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＧａｌＬＤＨ ａｎｄ ＡＰＸ ａｃｔｉｖｉｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒａｓｐｂｅｒｒｙ（Ｒｕｂｕｓ ｉｄａｅｕｓ）； ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ； ＧａｌＬＤＨ； ＡＡＯ； ＡＰＸ

維生素Ｃ是一種普遍存在于植物和大多數動物體內的一類高豐度己糖內酯化合物，而人類等少數動物自身不能合成維生素Ｃ，必須通過食物獲得［１］。所以，維生素Ｃ含量已成為果品質量的重要指標。維生素Ｃ對植物自身也具有重要意義，維生素Ｃ作為植物體內重要的還原劑之一，不僅參與清除植物光合、呼吸作用過程中產生的活性氧，而且作為多個酶的輔酶在多種生理代謝中發揮作用［２］。維生素Ｃ的還原態稱為抗壞血酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ，ＡｓＡ）， 氧化態統稱為脫氫抗壞血酸（Ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ，ＤＨＡ），二者都具有生物活性，并可相互轉化［２］。Ｌ－半乳糖酸－１，４－內酯脫氫酶（ＧａｌＬＤＨ）是ＡｓＡ生物合成途徑的關鍵酶［３］?？箟难嵫趸福ǎ粒粒希┖涂箟难徇^氧化物酶（ＡＰＸ）催化ＡｓＡ形成不穩定的單脫氫抗壞血酸（ＭＤＨＡ），再經過非酶歧化反應形成脫氫抗壞血酸（ＤＨＡ），ＤＨＡ除了部分被還原為ＡｓＡ外，其余的被氧化為２，３－二酮古洛糖酸［２］。

樹莓為薔薇科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）懸鉤子屬（Ｒｕｂｕｓ）多年生小灌木，其果實風味獨特，含有豐富的維生素Ｃ。目前關于樹莓果實中維生素Ｃ積累的生理機制尚不清楚。本試驗研究了４個不同品種樹莓果實發育過程中維生素Ｃ含量變化與ＧａｌＬＤＨ、ＡＡＯ及ＡＰＸ活性的關系，以期了解樹莓果實維生素Ｃ積累的生理機制，為高含量維生素Ｃ果樹的育種奠定基礎。

１材料與方法

１．１試驗材料

供試品種為哈瑞太慈（Ｈｅｒｉｔａｇｅ）、撒米特（Ｓｕｍｍｉｔ）、杜拉明（Ｔｕｌａｍｅｅｎ）、費爾杜德（Ｆｅｒｔｏｄ Ｚａｍａｔｏｓ）。各樹莓品種種植于黑龍江省農業科學院園藝分院，２０１１年５～１０月采取這４個品種的綠熟期、１／４紅熟期、１／２紅熟期、３／４紅熟期、紅熟期果實，取鮮果進行維生素Ｃ含量及各種酶活性的測定。

１．２各指標測定方法

１．２．１ＡｓＡ和ＤＨＡ含量的測定參考Ｔｕｒcｓáｎｙｉ等［４］及Ｔａｋａｈａｍａ等［５］的方法并作適當改進： 取約２ ｇ果實（不去果皮）在５％的偏磷酸中研磨勻漿，４ ℃ １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ 離心２０ ｍｉｎ，收集上清液用于測定ＡｓＡ和ＤＨＡ的含量。測定ＡｓＡ時吸?。保埃?μＬ的上清液加入到２ ｍＬ １００ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸鉀緩沖液（ｐＨ ６．８）中，當加入１ Ｕ的抗壞血酸氧化酶（ＥＣ１．１０．３．３，來自Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｓｐ．）后記錄２６５ ｎｍ下的吸光度。測定ＤＨＡ時吸?。保埃?μＬ上清液加入到２ ｍＬ １００ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸鉀緩沖液（ｐＨ ６．８）中，當加入２ ｍｍｏｌ／Ｌ二硫蘇糖醇（ＤＴＴ）后記錄２６５ ｎｍ下的吸光度。同時，用一系列已知濃度的ＡｓＡ和ＤＨＡ（Ｓｉｇｍａ公司產品）溶液用相同的方法制作標準曲線以計算樣品中ＡｓＡ、ＤＨＡ和ＡｓＡ＋ＤＨＡ（總維生素Ｃ）的含量。

１．２．２酶活性測定

１）ＧａｌＬＤＨ活性測定。酶液的提取參考安華明等［６］的方法。酶活性的測定參考Ｔａｂａｔａ等［７］的方法： ２．４ ｍＬ反應體系中含有２ ｍＬ １．０５ ｍｇ／ｍＬ的細胞色素Ｃ（Ｃｙｔ ｃ）、２００ μＬ ５６ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｌ－半乳糖內酯和２００ μＬ酶提取液。測定前先將反應液混合于２５ ℃溫育１ ｍｉｎ，反應從加入Ｌ－半乳糖內酯開始計時， 測定５５０ ｎｍ下的吸光度。１ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ Ｌ－半乳糖內酯氧化量（相當于Ｃｙｔ ｃ還原量為２ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ）為１個單位（Ｕ）。

２）ＡＰＸ及ＡＡＯ活性測定。采用Ｐｉｇｎｏｃｃｈｉ等［８］的方法：稱取約２ ｇ果實在４ ｍＬ含０．３ ｍｏｌ／Ｌ甘露醇、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１％牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、０．０５％半胱氨酸及２％ＰＶＰ 的５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩沖液（ｐＨ ７．２）中冰浴研磨，４ ℃ １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，收集上清液作為酶液。ＡＰＸ反應液含３ ｍＬ ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸鉀緩沖液（０．０９ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈ２Ｏ２， ０．０５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＡｓＡ， ｐＨ ７．４）和１００ μＬ的酶液。ＡＡＯ反應液含３ ｍＬ ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸鉀緩沖液（０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ， ０．１５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＡｓＡ， ｐＨ ７．０）和１００ μＬ的酶液。測定２６５ ｎｍ下吸光度的變化。此兩種酶的活性定義為：１ μｍｏｌ／ｍｉｎ ＡｓＡ的氧化量為１個單位（Ｕ）。

以上各生理指標的測定均重復３次。

１．３數據統計與分析

試驗數據采用ＤＰＳ數據處理系統進行分析。

２結果與分析

２．１樹莓果實不同發育時期ＡsＡ、ＤＨＡ和總維生素Ｃ含量的變化

總維生素Ｃ由氧化型（ＤＨＡ）和還原型（ＡsＡ）組成。從圖１可以看出，４個品種樹莓果實的ＡsＡ和總維生素Ｃ的含量隨果實的發育逐漸升高，而ＤＨＡ的含量逐漸降低，總維生素Ｃ和ＡsＡ的含量均在果實紅熟期達到最大值，雖然ＤＨＡ的含量在逐漸降低，但是并沒有影響ＡsＡ和總維生素Ｃ含量的升高，說明ＤＨＡ的含量只是樹莓果實維生素Ｃ庫中的極小部分。４個品種中費爾杜德的ＡsＡ含量和維生素Ｃ總含量都最高。

２．２樹莓果實不同發育時期ＧａｌＬＤＨ活性的變化

隨著樹莓果實的不斷成熟，ＧａｌＬＤＨ活性也不斷上升（圖２），ＧａｌＬＤＨ活性與ＡｓＡ和總維生素Ｃ含量的變化趨勢基本一致。在綠熟期４個品種的ＧａｌＬＤＨ活性差異不顯著，在隨后的果實發育時期，費爾杜德果實的ＧａｌＬＤＨ活性與其他３個品種差異顯著。相關性分析表明，４個品種中費爾杜德、杜拉明、哈瑞太慈紅熟期果實的ＧａｌＬＤＨ活性與ＡｓＡ積累呈極顯著正相關，相關系數分別為０．９８４ ５、０．９９０ ４和０．９５２ ６，撒米特的ＧａｌＬＤＨ活性與ＡｓＡ積累呈顯著正相關，相關系數為０．８４１ ３。由此可知ＧａｌＬＤＨ活性是決定ＡsＡ水平高低的主要因素之一。

２．３樹莓果實不同發育時期ＡＰＸ和ＡＡＯ活性的變化

ＡＰＸ的活性隨著ＡｓＡ含量的升高逐漸降低（圖３），可能會在一定程度上減少ＡｓＡ的氧化分解，有利于ＡｓＡ的積累。通過相關性分析可知，果實的ＡＰＸ活性與ＡsＡ含量相關不顯著，ＡＰＸ變化與ＤＨＡ含量的變化趨勢基本一致，杜拉明和撒米特紅熟期果實中的ＡＰＸ活性與ＤＨＡ含量呈極顯著正相關，相關系數分別為０．９６７ ８、０．９１３ ７，費爾杜德和哈瑞太慈紅熟期果實的ＡＰＸ活性與ＤＨＡ含量呈顯著正相關，相關系數分別為０．７６７ ８、０．８５６ ７。ＡＡＯ的活性隨著果實的成熟先升高后略有降低（圖４），ＡＡＯ活性與維生素Ｃ含量的相關性分析結果表明，二者不存在顯著相關關系。

３小結與討論

高等植物ＡｓＡ生物合成和代謝途徑被逐漸揭示，特別是明確了ＡｓＡ生物合成的Ｌ－半乳糖途徑［３］。Tokunaga等［９］對轉正義ＧａｌＬＤＨ基因的煙草進行研究，發現ＧａｌＬＤＨ會過量表達，而且增加了轉基因煙草中的ＡｓＡ含量。研究結果表明，ＧａｌＬＤＨ活性與ＡｓＡ積累呈顯著正相關，這與以刺梨為試驗材料的研究結果基本一致［６］，且此次研究中高ＡｓＡ含量的樹莓品種費爾杜德中ＧａｌＬＤＨ活性顯著高于其他3個品種，所以認為樹莓果實中ＡsＡ含量的差異與ＧａｌＬＤＨ存在密切關系。同時，ＡＰＸ和ＡＡＯ對ＡｓＡ的積累也有不可忽視的作用。通過相關性分析可知，ＡＰＸ活性與ＡｓＡ含量相關不顯著，與ＤＨＡ含量呈顯著正相關，表明ＡＰＸ是將ＡｓＡ氧化進而形成ＤＨＡ的主要酶。ＡＡＯ的活性隨著果實的成熟先升高后略有降低，通過對果實發育各個時期的ＡＡＯ活性與ＡsＡ含量的相關性分析發現，兩者相關性不顯著。ＡＰＸ和ＡＡＯ在果實發育到３／４紅熟期和紅熟期時活性很低，因而在這段時期后ＡｓＡ極少氧化分解，這是樹莓果實能夠積累高水平ＡｓＡ的另一重要原因。這樣，一方面ＡｓＡ在持續不斷地合成，另一方面其氧化損失很少，從而使維生素Ｃ高水平積累。

雖然研究明確了ＧａｌＬＤH、ＡＰＸ及ＡＡＯ在樹莓果實維生素Ｃ積累中的作用，但是植物維生素Ｃ的積累與其合成、代謝、再生及環境等多因素有關，再生循環及環境因素對維生素Ｃ積累的影響也值得進一步研究。

參考文獻：

［１］ 劉永立，胡海濤，蘭大偉． 維生素Ｃ的生物合成及其基因調控研究進展［Ｊ］． 果樹學報，２００６，２３（３）：４３１－４３６．

［２］ 陳坤明，宮海軍，王鎖民． 植物抗壞血酸的生物合成、轉運及其生物學功能［Ｊ］． 西北植物學報，２００４，２４（２）：３２９－３３６．

［３］ ＷＨＥＥＬＥＲ Ｇ Ｌ，ＪＯＮＥＳ Ｍ Ａ， ＳＭＩＲＮＯＦＦ Ｎ． Ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９３：３６５－３６９．

［４］ ＴＵＲＣＳ?魣ＮＹＩ Ｅ，ＬＹＯＮＳ Ｔ， ＰＬ?魻ＣＨＬ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｄｏｅｓ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｌｉｎｅ ｄｅｆｅｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｏｚｏｎｅ？Ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｐｔ ｕｓｉｎｇ ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ Ｌ．）［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｔｙ，２０００，５１（３４６）：９０１－９１０.

［５］ ＴＡＫＡＨＡＭＡ Ｕ， ＯＮＩＫＩ Ｔ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｐｏｐｌａｓｔ ｏｆ ｓｐｉｎａｃｈ ｌｅａｖｅｓ ｂｙ ａｓｃｏｒｂａｔｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９２，３３（４）：３７９－３８７．

［６］ 安華明，陳力耕，樊衛國，等． 刺梨果實中維生素Ｃ積累與相關酶活性的關系［Ｊ］．植物生理與分子生物學學報，２００５，３１（４）：４３１－４３６．

［７］ ＴＡＢＡＴＡ Ｋ，ＯＢＡ Ｋ，ＳＵＺＵＫＩ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ｆｏｒ Ｌ－ｇａｌａｃｔｏｎｏ－１，４－ｌａｃｔｏｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｊ，２００１，２７（２）：１３９－１４８．

［８］ ＰＩＧＮＯＣＣＨＩ Ｃ， ＫＩＤＤＬＥ Ｇ， ＨＥＲＮ?魣ＮＤＥＺ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ａｓｃｏｒｂａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｄｏｘ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｐｏｐｌａｓｔ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｆｅｎｓｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００６，１４１（２）：４２３－４３５．

［９］ TOKUNAGA T， MIYAHARA K， TABATA K， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ－ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ｆｏｒ Ｌ－ｇａｌａｃｔｏｎｏ－１，４－ｌａｃｔｏｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔａ，２００５，２２０（６）：８５４－８６３．