利用定量ＰＣＲ方法檢測鹽、磷對菌根真菌侵染紫云英的影響

周艷菲 林會 趙斌

摘要：建立了菌根真菌（ＡＭF）的ＤＮＡ含量和ＴＢ染色所觀察的侵染率之間的相關性曲線。將熒光定量ＰＣＲ技術運用到ＡＭＦ對植物紫云英（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．）的侵染率檢測中，實現了混合侵染條件下對菌根中ＡＭＦ的種類和侵染率同時進行定性和定量檢測。在盆栽實驗中，利用所建立的方法檢測了不同鹽、磷濃度及交互作用對ＡＭＦ侵染紫云英的影響，結果表明，不同磷濃度下，鹽濃度的增加對Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ和Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ侵染率的影響不同。Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在混合接種中占有絕對的優勢。從ＡＭＦ對紫云英的促生效果上看，ＡＭＦ侵染率的增加提高了紫云英的抗鹽脅迫能力，促進了植物生長。

關鍵詞：定量ＰＣＲ；菌根真菌（ＡＭF）；紫云英（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．）；鹽脅迫；磷

中圖分類號：Ｑ９３９．５文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）15－3193-05

Ｕｓｉｎｇ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ａｎｄ Ｓａｌｔ ｏｎ ｔｈｅ

Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＭ Ｆｕｎｇｕｓ ｔｏ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ.

ＺＨＯＵ Ｙａｎ－ｆｅｉ，ＬＩＮ Ｈｕｉ，ＺＨＡＯ Ｂｉｎ

（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ＤＮＡ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｓｙｓｔｅｍ were established ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ＴＢ ｓｔａｉｎ ｍｅｔｈｏｄ. Tｈｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ was ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ＡＭF ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ mixture ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｌｉａｂｌｙ． Ｉｔ ｃould ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉａｌ ｔａｘａ ｏｆ ＡＭＦ ｉｎ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｓｏｉｌｓ ｃｏｌｏｎｉｚｅｄ ｂｙ ｓｅｖｅｒａｌ ｔａｘａ． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｓａｌｔ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｏｎ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＭ ｆｕｎｇａｌ ｔｏ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ， which was ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｗｉｔｈ ａ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｗａｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ， ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓe ｏｆ ｓａｌｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈａｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ ａｎｄ Ｇ. ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ ｔｏ ｈｏｓｔ ｐｌａｎｔｓ． Ｗｈｉｌｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｘ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ， ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｕｓｕａｌｌｙ ｄｏｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｑＰＣＲ； ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ ｆｕｎｇｉ； Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．； ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ； ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ

目前全世界已有８億ｈｍ２的土地出現鹽漬化［１］，嚴重影響了土地資源的利用，鹽脅迫造成的低水勢、Ｎａ＋毒害作用和營養元素分布不均衡，可使植物減產甚至不生長［２］。菌根真菌（ＡＭＦ）作為一類可以與地球上８０％的陸生植物共生的古老微生物［３］，能促進植物對土壤中Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｐ等礦質元素的吸收，調節宿主植物的代謝活動［４］，提高宿主植物抗重金屬、抗旱和抗鹽脅迫能力。鹽對菌根的影響主要表現在減少孢子數量和抑制菌絲生長［５］，減少其再次侵染宿主的機會，降低菌根侵染率。盡管存在這種抑制作用，仍有大量研究結果表明ＡＭＦ可以提高宿主抗鹽脅迫能力，不同ＡＭＦ抗鹽脅迫的能力不一樣，對植物生長的促生效果也不同［６］。

在生態系統中，同一宿主植物能被多種ＡＭＦ同時侵染，利用傳統的ＴＢ染色和形態學觀察方法難以對菌根中不同的ＡＭＦ進行區分［７，８］。而分子生物學方法可用于檢測混合侵染的菌根中ＡＭＦ的組成［９］。實時熒光定量ＰＣＲ技術可以準確測定樣品中特定基因的拷貝數。Ａｌｋａｎ等［１０，11］對Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ設計特異性引物，使用熒光定量ＰＣＲ方法第一次對單接種條件下菌根中ｒＤＮＡ進行了絕對定量，研究表明菌根總侵染率（包含菌絲、叢枝、泡囊）和熒光定量ＰＣＲ測得的結果之間具有相關性，相關性程度大小與宿主植物聯系緊密。隨后，進一步將該方法應用在雙接種研究中，分別檢測Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ和Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在不同處理時的侵染率變化，發現不同處理下Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在苜蓿中都占絕對優勢。Ｇａｍｐｅｒ等［１2］運用實時熒光定量的方法對５種ＡＭＦ進行定量分析，發現孢子數量和定量ＰＣＲ檢測的結果之間有很強的相關性，定量ＰＣＲ方法的可行性取決于具體的實驗內容，這種方法是研究生態系統中特定的ＡＭＦ總核酸量的有效方法。

本研究探討單接種條件下Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ和Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ用定量ＰＣＲ方法檢測的結果與ＴＢ染色觀察結果之間的相關性，建立了定量ＰＣＲ方法檢測混合接種條件下各種ＡＭＦ侵染率的方法。在此基礎上以紫云英為宿主植物，Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ和Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ為試驗菌種，設置鹽和磷交互作用的盆栽實驗，定量ＰＣＲ方法檢測了鹽、磷交互作用下兩種ＡＭＦ侵染紫云英的變化，比較單接種和雙接種條件下每種ＡＭＦ侵染的變化。

１材料與方法

１．１實驗材料

供試植物：紫云英（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．），種子消毒、催芽方法參考Ｐｅｎｇ等［８］的實驗方法。

供試真菌：Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ。原始菌種由北京農林科學院提供，以此進行擴繁，將ＡＭＦ侵染紫云英６個月的混合物作為接種劑，其中含有被感染的植物根段、ＡＭＦ菌絲、孢子和盆栽土壤混合物。

供試土壤：采自華中農業大學實驗田，土壤經自然風干后磨碎并過２ ｍｍ的篩網，將河沙洗凈曬干后與土２∶１（Ｖ／Ｖ）混合均勻，１２１ ℃間歇滅菌３次。土壤理化性質：ｐＨ ６．５９，電導率為７３．６ μＳ／ｃｍ，速效磷含量為１１．８３ ｍｇ／ｋｇ。

１．２實驗方法

１．２．１定量ＰＣＲ方法的應用用粗提法提取紫云英ＤＮＡ［８］，利用嵌套ＰＣＲ方法獲取紫云英ＬＲ１－ＮＤＬ２２區段間的序列［４］。將獲得的序列在ＮＣＢＩ上進行比對（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ），分別設計上述３個物種的特異性引物并用普通ＰＣＲ進行驗證，ＰＣＲ反應程序參考Ｐｅｎｇ等［8］的方法。

分別提取Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅ、Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ和紫云英的ＤＮＡ，測定濃度后，利用熒光定量ＰＣＲ技術分別建立兩種ＡＭＦ孢子、紫云英ＤＮＡ濃度和ＣＴ值關系的標準曲線。為了進一步檢驗ＡＭＦ引物的特異性和敏感性，將ＡＭＦ的孢子ＤＮＡ做梯度稀釋，分別與一定量的紫云英ＤＮＡ混合，建立混合體系中ＡＭＦ孢子ＤＮＡ的標準曲線。在此基礎上，制備一系列不同侵染率根樣［１０］，提取ＤＮＡ，用熒光定量ＰＣＲ進行擴增，計算不同侵染率下ＣＤＮＡ（ＡＭＦ）／ＣＤＮＡ（plant）與ＴＢ染色顯微觀察的侵染率之間的相關性。

熒光定量ＰＣＲ采用ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ公司）試劑，反應體系：２０ μＬ體系中含有１０ μＬ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｋｉｔ， ０．５ μｍｏｌ上、下游引物，２．０ μＬ ＤＮＡ模板，補水至２０ μＬ。反應在ＡＢＩ７３００熒光定量ＰＣＲ儀進行，ＰＣＲ反應程序：９５ ℃（２０ ｓ）、９５ ℃（２０ ｓ）、６０ ℃（２０ ｓ）、７２ ℃（３０ ｓ），進行４０個循環；然后進行溶解曲線分析。

１．２．２盆栽實驗以ＫＨ２ＰＯ４的方式加入磷，鹽脅迫處理使用ＮａＣｌ。實驗設置３個磷水平（０、３０、６０ ｍｇ／ｋｇ）和３個鹽水平（０、０．３５、１．０５ ｇ／ｋｇ），共９種處理，每種處理設置不接種、單接種Ｇ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅ、單接種Ｇ ｍｏｓｓｅａｅ和雙接種（１∶１，Ｖ／Ｖ）４種接種方式，共３６個處理，每個處理３次重復，共計１０８盆。每盆裝土５００ ｇ，接種處理每盆加１３％接種劑，對照組加等量滅菌的接種劑。參照“１．１”的方法進行種子滅菌和催芽。

１．２．３侵染率測定第７周收獲時將植株取出、洗凈后，取新鮮根０．２ ｇ用于抽提ＤＮＡ，用熒光定量ＰＣＲ方法檢測ＡＭＦ侵染率。實驗數據用ＳＰＳＳ １６．０進行統計分析。

２結果與分析

２．１定量ＰＣＲ方法中特異性引物的設計及驗證

分別以植物、Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ孢子、Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ孢子的ＤＮＡ為模板，用各自的特異性引物對上述３種模板行進行驗證（圖１，從左往右膠圖順序分別是Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ， Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和紫云英特異性引物驗證結果，１－５泳道的模板分別為負對照，紫云英，Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ，５０ ｂｐ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ）。ＡＭＦ及植物的引物都具有特異性，通過在熒光定量ＰＣＲ儀器上進行驗證，各自的溶解曲線為單峰，說明這３對引物可以用于熒光定量ＰＣＲ方法中，引物序列及名稱：ＬＲ１－ＮＤＬ２２［８］，Ｇｉ－Ｒ／ＲＴ－Ｆ：ＡＡＴＣＡＧＣＣＴＴＴＣ

ＧＧＧＴ，ＴＡＣＣＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＴＧ；Ｍｏｓ－Ｆ／Ｍｏｓ－Ｒ［１１］，ＡＳＦ６／ＡＳＲ６［１３］。

２．２ＡＭＦ和紫云英ＤＮＡ標準曲線建立

分別用Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ、Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ、紫云英的特異性引物進行ＰＣＲ，得到熒光定量ＰＣＲ的ＣＴ值與各自ＤＮＡ濃度之間的標準曲線（圖２）。Ｇｉ－Ｒ／ＲＴ－Ｆ擴增的ＤＮＡ濃度范圍為３．２×１０－３～３２.0 ｎｇ，線性方程為ｙ＝－３．１９１ｘ＋２７．２５０，Ｒ２＝０．９９９ ０（圖２ａ）；Ｍｏｓ－Ｆ／ Ｍｏｓ－Ｒ擴增的ＤＮＡ濃度范圍在１．６×１０－３～２５.0 ｎｇ， 線性方程為ｙ＝－３．２１９ｘ＋２４．１６７，Ｒ２＝０．９９８ ９（圖２ｂ）；ＡＳＦ６／ＡＳＲ６擴增的ＤＮＡ濃度范圍為３．５×１０－４～３５.0 ｎｇ，線性方程為ｙ＝－３．４０３ｘ＋２１．２７０，Ｒ２＝０．９９９ ６（圖２ｃ）。擴增效率分別是１０５．４％、１０５．５％、９８．８％。

２．３定量ＰＣＲ檢測ＡＭＦ特異引物的靈敏性

在模擬實驗條件下，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ ＤＮＡ （０．０１６，０．０８０，０．４００，２．０００，１０．０００，５０．０００ ｎｇ）分別與３５．０、１１．７和３．５ ｎｇ（圖３a）紫云英ＤＮＡ混合，擴增的ｌｏｇＣＤＮＡ與ＣＴ值之間的線性方程分別為，ｙ＝

－３．３０３ｘ＋２８．２３７，Ｒ２＝０．９９６ ８；ｙ＝－３．５２６ｘ＋２８．７３１， Ｒ２＝０．９９４ ０；ｙ＝－３．２５６ｘ＋２８．５３４，Ｒ２＝０．９９０ ９；擴增效率分別為１００．７７％，９６．３１％，９７．６5％。Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ ＤＮＡ（０．０８０，０．４００，２．０００，１０．０００，５０．０００ ｎｇ） 分別與１５．０、５．０和１．０ ｎｇ（圖３b）紫云英ＤＮＡ混合，擴增的ｌｏｇＣＤＮＡ與ＣＴ值之間的線性方程分別為ｙ＝－３．３９６ｘ＋２５．５５５，Ｒ２＝０．９９７ ５；ｙ＝－３．４２９ １ｘ＋２５．６０２，Ｒ２＝０．９９７ ８；ｙ＝－３．３０８ｘ＋２５．２１６，Ｒ２＝０．９９５ ８，擴增效率分別為９９．３３0％，９７．９９６％，９７．６４８％，１０６．８０８％。當ＡＭＦ的ＤＮＡ模板濃度在０．０１６～５０．００0 ｎｇ范圍內都能得到良好的擴增，這說明ＡＭＦ的特異引物可以在混雜ＤＮＡ存在時準確、靈敏地檢測出目的基因。

２．４根樣侵染率與ＣＤＮＡ（ＡMＦ）/ＣＤＮＡ（pｌａｎｔ）線性關系模擬

在模擬實驗下確定了ＡＭＦ引物在熒光定量ＰＣＲ運用于ＡＭＦ ＤＮＡ檢測具有特異性及靈敏性的基礎上，用盆栽實驗的根樣，建立ＣＤＮＡ（ＡMＦ）/ＣＤＮＡ（pｌａｎｔ） 與ＴＢ染色顯微觀察結果之間的關聯性。結果表明ＣＤＮＡ（ＡMＦ）/ＣＤＮＡ（pｌａｎｔ）與侵染率有明顯的相關性（Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ，ｙ＝０．１０６ ７ｘ－０．００４ ９，Ｒ２＝０．９６７ ６）； Ｇ． ｉｎｔｒａｄｉｃｅｓ，ｙ＝０．１２１ ２ｘ＋０．００２ ３，Ｒ２＝０．９６１ ８）（圖４）。利用ｑＰＣＲ方法檢測出實際根樣中的ＣＤＮＡ（ＡMＦ）/ＣＤＮＡ（pｌａｎｔ）值隨著侵染率的變化而呈現出相應的變化，表明本方法可以用于直接檢測實際侵染根樣中各種ＡＭＦ的侵染率。

２．５不同處理對ＡＭＦ侵染紫云英的影響

定量ＰＣＲ檢測的結果得到不同ＡＭＦ對植物的侵染率如圖５。在低磷時，鹽濃度增加，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ侵染率逐漸降低；中磷和高磷條件下隨著鹽濃度的增加，其侵染率先升高后降低。高鹽濃度處理時，其ＤＮＡ含量分別減少了６１．５８％、２８．０７％、１５．４６％，說明Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ的侵染率隨著鹽濃度的增加而降低，在高鹽濃度時，與正常鹽濃度下相比，其相對ＤＮＡ含量分別減少了５１．５４％、６６．２０％、６７．７１％，磷含量的增加進一步降低了Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ的侵染率，說明磷進一步抑制其侵染。而雙接種條件下，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的侵染率都要高于Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ的侵染率，同樣處理下Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ侵染率有時僅為Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的５８．６７％，表明混合接種促進了Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ侵染紫云英。

２．６不同磷水平和鹽水平下接種ＡＭＦ對紫云英生物量的影響

從表１可以看出，在各種處理下，接種ＡＭＦ的紫云英干重要高于未接種的紫云英，說明了ＡＭＦ可以提高紫云英的抗鹽性。其中在中磷條件下顯示出最佳促生效果，而低磷條件下次之，高磷條件最差。中磷濃度（３０ ｍｇ／ｋｇ）下，在低鹽時，Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ促生效果介于Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和混合接種之間，在高鹽條件時單接種Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的促生效果最好，Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ促生效果最差。

３小結與討論

ＴＢ染色觀察Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ這兩種ＡＭＦ對紫云英的侵染率和定量ＰＣＲ檢測的相關系數分別為０．９８０ ７和 ０．９５１ ３，說明直接用定量ＰＣＲ方法檢測ＡＭＦ的侵染率與ＴＢ染色檢測的浸染率之間的線性關系良好。定量ＰＣＲ方法檢測ＡＭＦ的侵染率可以用來研究不同ＡＭＦ對不同宿主的偏好性、在宿主植物中的分布狀態，還可以運用于分子生態學研究中，通過檢測土樣中ＡＭＦ的ＤＮＡ含量，篩選出抗環境脅迫的高效菌種，可以加大這類ＡＭＦ的利用。本研究利用定量ＰＣＲ方法檢測ＡＭＦ的侵染率的研究結果與Ａｌｋａｎ等［１１］的研究結果相似，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在混合接種中對宿主植物的侵染率最高。而Ｊａｎｓａ等［１４］在運用實時熒光定量ＰＣＲ技術研究Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ，Ｇｌｏｍｕｓ ｃｌａｒｏｉｄｅｕｍ單接種或者混合接種侵染苜蓿時，發現Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ對宿主植物的侵染率最高，說明ＡＭＦ對宿主植物具有一定的偏好性。目前對利用實時熒光定量ＰＣＲ檢測不同ＡＭＦ侵染率的可行性還存在爭議。

在不同磷濃度下，隨著鹽濃度的增加，紫云英的生物量都減少，但接種ＡＭＦ的紫云英生物量都要高于未接種的紫云英，表明ＡＭＦ促進了紫云英在鹽漬環境中的生長。高磷（６０ ｍｇ／ｋｇ）濃度下，隨著鹽濃度的增加，菌根紫云英生物量變化不大，可能是紫云英吸收了大量磷減少了對鹽的吸收，這與之前利用施加營養元素緩解鹽脅迫的結論是一致的［１５］。可能是植物吸收磷抑制了對鹽的吸收，植物對鹽和磷的吸收存在競爭性關系［１６］。在中磷（３０ ｍｇ／ｋｇ）濃度下，低鹽時Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ促生效果介于Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和混合接種之間；高鹽時單接種Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的促生效果最好，Ｇ． ｍｏｓｓｅａｅ促生效果最差，不同的接種方式促生效應不一樣，而鹽和磷對ＡＭＦ間的相互作用關系也產生影響。

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［１１］ ＡＬＫＡＮ Ｎ， ＧＡＤＫＡＲ Ｖ，ＹＡＲＤＥＮ Ｏ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ， Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ ａｎｄ Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ， ｂｙ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００６，７２（６）：４１９２．

［１２］ ＧＡＭＰＥＲ Ｈ Ａ， ＹＯＵＮＧ Ｊ Ｐ Ｗ． Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ： Ａｒｅ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｕｎｉｔ ｏｆ ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇａｌ ａｂｕｎｄａｎｃｅ？［Ｊ］． Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００８，４５（５）： ５８１－５９６．

［１３］ ＬＩ Ｙ Ｘ， ＺＨＯＵ Ｌ， ＬＩ Ｙ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｄｕｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｌａｎｔ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ， ＡｓＮＯＤＦ３２， ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｎｏｄｕｌｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｍａｎｕｒｅ ｌｅｇｕｍｅ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ［Ｊ］． Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ， ２００８，１８０（１）：１８５－１９２．

［１４］ ＪＡＮＳＡ Ｊ， ＳＭＩＴＨ Ｆ Ａ， ＳＭＩＴＨ Ｓ Ｅ． Ａｒｅ ｔｈｅｒｅ ｂｅｎｅｆｉｔｓ ｏｆ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｒｏｏｔ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ？［Ｊ］． Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，２００８，１７７（３）：７７９－７８９．

［１５］ 段德玉，劉小京，李存楨． Ｎ素營養對ＮａＣｌ脅迫下鹽地堿蓬幼苗生長及滲透調節物質變化的影響［Ｊ］．草業學報，２００５，１４（１）：６３－６８．

［１６］ ＰＦＥＩＦＦＥＲ Ｃ Ｍ， ＢＬＯＳＳ Ｈ Ｅ. Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｕａｙｕｌｅ （Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ） ｉｎ ａ ｓａｌｉｎｅ ｓｏｉｌ ａｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ－ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，１９８８，１０８（３）：３１５－３２１．