Ｄ型產氣莢膜梭菌青海分離株ε毒素遺傳變異分析

冶貴生

摘要：研究Ｄ型產氣莢膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）青海分離株ε毒素基因的遺傳變異特點，試驗設計特異性引物擴增ε毒素基因，目的基因片段大小為８８８ ｂｐ。建立ＰＣＲ反應體系并設置反應條件，擴增產物進行電泳檢測、純化、測定核苷酸序列，與參考序列進行同源比對分析。結果表明，目的基因擴增良好，分離菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ與菌株Ｃ６０－３、ＮＣＴＣ ８３４６、Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ、ＡＪ２５０９５６的核苷酸序列的同源性依次為９９．９％、９９．８％、９８．９％、９９．４％。

關鍵詞：Ｄ型產氣莢膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）；ε毒素；遺傳變異

中圖分類號：Ｓ８５２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）15－3183-03

Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ε Ｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ Ｔｙｐｅ Ｄ Iｓｏｌａｔｅｄ from Ｑｉｎｇｈａｉ

ＹＥ Ｇｕｉ－ｓｈｅｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ， Ｑｉｎｇｈａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｉｎｇ ８１００１６，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ε ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｔｙｐｅ Ｄ isolated from Qinghai，ｐｒｉｍｅｒｓ of which PCR product length was 888 bp was designed ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ε ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ． Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ was ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ； ｔｈｅｎ its ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ was analyzed． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｖｅｒｙ ｗｅｌｌ， ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｒａｔｅ was ９９．９％、９９．８％、９８．９％、９９．４％ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｑｉｎｇｈａｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｓｔｒａｉｎ Ｃ６０－３， ｓｔｒａｉｎ ＮＣＴＣ ８３４６， ｓｔｒａｉｎ Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ， ｓｔｒａｉｎ ＡＪ２５０９５６ ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｔｙｐｅ Ｄ； ε ｔｏｘｉｎ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ

產氣莢膜梭菌又稱魏氏梭菌，是一種人畜共患病的革蘭氏陽性菌，產芽胞，在自然界分布極廣，土壤、飼料、蔬菜等均有分布。產氣莢膜梭菌分型較多，其中Ｄ型產氣莢膜梭菌嚴重危害養羊業，其引起的疾病為羊腸毒血癥，該病潛伏期短，發病快，死亡快［１］。Ｄ型產氣莢膜梭菌主要產生α和ε兩種毒素，其中α毒素具有磷脂酶的活性［２］，ε毒素前體被激活后會對細胞產生毒性并增加血管滲透性［３］。青海地處青藏高原，是我國重要的牧區之一，綿羊養殖業在青海牧區養殖業中所占比重較大，鑒于產氣莢膜梭菌的致病特點，該菌對青海省養羊業構成一定程度的威脅，因此，本研究通過測定并分析Ｄ型產氣莢膜梭菌青海分離株ε毒素基因的核苷酸變異特點，旨在為青海省產氣莢膜梭菌病的防治提供基礎依據。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１菌株Ｄ型產氣莢膜梭菌為臨床分離并保存于青海大學農牧學院預防獸醫學實驗室。

１．１．２試劑Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶為寶生物（大連）有限公司產品，細菌基因組提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產品、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ為寶生物（大連）有限公司產品，硫乙醇酸鹽流體培養基為北京路橋技術有限責任公司產品。

１．１．３引物根據ＮＣＢＩ上登錄的產氣莢膜梭菌ε毒素基因序列設計特異性引物，預期目的片段大小為８８８ ｂｐ。上游引物：５′－ＡＡＧＧＡＡＡＴＡＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＡＴＣＴＡＡＴＧ－３′；下游引物：５′－ＴＴＴＴＡＴＴＣＣＴ

ＧＧＴＧＣＣＴＴ－３′。

１．２方法

１．２．１增菌培養按培養基說明書配制，無菌操作進行產氣莢膜梭菌的厭氧培養。

１．２．２ＤＮＡ提取參照細菌基因組提取試劑盒說明書進行。

１．２．３毒素基因的ＰＣＲ擴增反應體系：Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、ｄＮＴＰ ４ μＬ、上游引物 １ μＬ、下游引物 １ μＬ、模板 １ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 ０．５ μＬ、補滅菌水至５０ μＬ。反應條件：９４ ℃ １ ｍｉｎ、４７ ℃ １ ｍｉｎ、７２ ℃ １ ｍｉｎ，３５個循環，然后７２ ℃ １０ ｍｉｎ，４ ℃ 保存。

１．２．４擴增結果檢測擴增結束后取５ μＬ擴增產物進行１％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。

１．２．５序列分析將擴增產物純化后測序并進行同源性分析。

２結果與分析

２．１ε毒素基因ＰＣＲ擴增檢測

ε毒素基因所在泳道２出現目的條帶，目的基因條帶清晰，表明擴增效果良好（圖１）。

２．２ε毒素基因核苷酸序列分析

應用ＤＮＡｓｔａｒ軟件對所測菌株ε毒素基因核苷酸進行分析，結果表明（表1）所測青海分離株ε毒素基因Ａ＋Ｔ含量較高，其堿基組成含有較多的腺嘌呤和胸腺嘧啶。

２．３ε毒素基因核苷酸序列同源性分析

選擇ＮＣＢＩ登錄的４株Ｄ型產氣莢膜梭菌（菌株Ｃ６０－３、ＮＣＴＣ ８３４６、Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ、ＡＪ２５０９５６）的ε毒素基因與所測青海分離菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ進行同源比對分析。比對結果表明，菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ的ε毒素基因與參考菌株核苷酸序列同源性依次為９９．９％、９９．８％、９８．９％、９９．４％（圖２），所測菌株與菌株 Ｃ６０－３之間有１處核苷酸突變；與菌株 ＮＣＴＣ ８３４６之間有２處核苷酸突變；與菌株Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ之間有５處核苷酸突變；與菌株ＡＪ２５０９５６有２處核苷酸突變（圖３）。

３討論

Ｄ型產氣莢膜梭菌可產生α和ε兩種毒素，毒素是該菌致病的主要因素，ε毒素編碼基因位于細菌大質粒上，當細菌侵入宿主體內后ε毒素以前體形式被分泌出來，在腸道內毒素前體的Ｎ端和Ｃ端部分氨基酸被腸道內的蛋白酶切除后轉變成有活性的毒素，從而造成機體組織器官的損傷。ε毒素可與細胞膜上的受體結合并在膜上形成孔隙從而造成細胞內外離子濃度的變化，進而引起細胞死亡。本研究所測Ｄ型產氣莢膜梭菌青海分離株ε毒素基因長度為８８８ bp，從ε毒素基因序列同源性分析結果來看，菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ與菌株Ｃ６０－３親緣關系最近；與菌株ＮＣＴＣ ８３４６和菌株 ＡＪ２５０９５６的親緣關系次之；與菌株 Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ親緣關系最遠。另外，從ε毒素基因序列同源性比對結果可知，菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ與菌株Ｃ６０－３之間１處的核苷酸突變，為Ｃ－Ａ突變；與菌株ＮＣＴＣ ８３４６之間的２處核苷酸突變，均為Ｃ－Ａ突變；與菌株Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ之間的５處核苷酸突變，分別為2處Ｔ－Ｇ突變、１處Ｔ－Ａ突變、１處Ｇ－Ａ突變和１處Ａ－Ｔ突變；與菌株ＡＪ２５０９５６的２處突變為Ｇ－Ａ突變和Ａ－Ｔ突變，上述突變均為點突變，這說明Ｄ型產氣莢膜梭菌可通過ε毒素基因的變異來適應不同的地域環境，通過遺傳變異加強自身適應不同生存環境的能力。

參考文獻：

［１］ 陳敷言．獸醫傳染病學［Ｍ］． 第五版．北京，中國農業出版社，２００６．３１５－３１６．

［２］ ＲＯＯＤ Ｊ Ｉ，ＭＣＣＬＡＮＥ Ｂ Ａ，ＳＯＮＧＥＲ Ｊ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｃｌｏｓｒｒｉｄｉａ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｍ］． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７.２２３－２４２．

［３］ ＭＩＹＡＬＭＯＴＯ Ｏ， ＭＩＮＡＭＩ Ｊ， ＴＯＹＯＳＨＩＭＡ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｅｐｓｉｌｏｎ ｔｏｘｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｖｉａ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， １９９８，６６（6）：２５０１－２５０８．