土壤磷酸酶測定中不同緩沖溶液對顯色液吸收波長的影響

夏棟,許文年,趙自超,趙娟,祝順波

摘要：確定了土壤磷酸酶測定時最大吸收波長以及顯色時應加入的最佳ｐＨ緩沖溶液。研究結果表明，加入ｐＨ為８．０~１０．０的緩沖液時顯色時間快，在可見光區的最大吸收峰在６０４ ｎｍ處，其中以ｐＨ ９．０的吸光度最高，摩爾吸光系數為１．７１７×１０４ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ），靈敏度較高。因此確定加入的最佳緩沖溶液ｐＨ為９．０，同時選擇６０４ ｎｍ作為最大吸收波長。

關鍵詞：土壤磷酸酶；緩沖溶液；吸收波長；ｐＨ；測定

中圖分類號：Ｏ６５７．３２；Ｓ１５１．９文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）05－0997-02

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Dｉｆｆｅｒｅｎｔ Bｕｆｆｅｒ Sｏｌｕｔｉｏｎ ｏｎ Aｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Wａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｉｎ Dｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ

Sｏｉｌ Pｈｏｓｐｈａｔａｓｅ

ＸＩＡ Ｄｏｎｇ，ＸＵ Ｗｅｎ－ｎｉａｎ，ＺＨＡＯ Ｚｉ－ｃｈａｏ，ＺＨＡＯ Ｊｕａｎ，ＺＨＵ Ｓｈｕｎ－ｂｏ

（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｅｃｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，

Ｙｉｃｈａｎｇ ４４３００２， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Tｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐＨ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｉｌ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｈａd ｂｅｅｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ８．０～１０．０ ｃｏｌｏｒｅｄ ｆａｓｔ， ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｅａｋ was ６０４ ｎｍ． Ｔｈｅ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｄｄｅｄ ｔｈｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ＝９．０） ｗａｓ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ， ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌａｒ ａｂｓｏｒｐｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ １．７１７ × １０４ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ）． Ｔｈｅ ｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎ ｗａｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐＨ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ９．０， ａｎｄ ６０４ ｎｍ ｗａｓ ｃｈｏｓｅｎ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｉｌ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： sｏｉｌ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ； bｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ； aｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ； ｐＨ； dｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ

土壤磷酸酶是一類催化土壤有機磷化合物礦化的酶，其活性高低直接影響著土壤中有機磷的分解轉化及其生物有效性，可作為反映土壤磷素水平的一項生物指標［１］。目前常用的測定方法為有機基團含量法［２］，但測定時波長的選擇上卻不一致，分別有５７８ ｎｍ［３，４］、６００ ｎｍ［５］、６６０ ｎｍ［２，６］。同時在吸取土壤濾液進行顯色時，加入一定體積的緩沖溶液的ｐＨ值也不統一，有９．０［４］、９．４［２］、９．６［３］。根據這些情況，本研究對土壤磷酸酶測定時不同緩沖溶液對顯色液吸收波長的影響進行了研究，并在波長與緩沖溶液的選擇中得到最優結果。

１實驗部分

１．１儀器與試劑

１．１．１儀器Ｕ－３０１０紫外－可見分光光度計（日本日立）；１ ｃｍ石英比色皿；５０ ｍＬ容量瓶。

１．１．２試劑酚工作液：１ ｇ重蒸酚溶于蒸餾水中，稀釋至１ Ｌ，貯于棕色瓶中，取１０ ｍＬ 酚溶液稀釋至１ Ｌ（每毫升含０．０１ ｍｇ苯酚）即為酚工作液；氯代二溴對苯醌亞胺試劑：０．２ ｇ氯代二溴對苯醌亞胺溶于１００ ｍＬ無水乙醇中；系列緩沖溶液的配制：ｐＨ ５．０～５．８采用乙酸－乙酸鈉緩沖溶液配制，ｐＨ ６．０～７．８采用磷酸鹽－檸檬酸鹽緩沖溶液配制。ｐＨ ８．０～９．０采用硼酸－硼酸鹽緩沖溶液配制，ｐＨ ９．２～１０．０采用硼砂－氫氧化鈉緩沖溶液配制。配制方法見文獻［２］。

１．２實驗方法

吸取１０ ｍＬ酚工作液（０．０１ ｍｇ／ｍＬ）于５０ ｍＬ容量瓶中，分別加入５ ｍＬ上述配制的不同緩沖液，搖勻后加入６滴氯代二溴對苯醌亞胺試劑，顯色后稀釋至刻度，３０ ｍｉｎ后用１ ｃｍ 石英比色皿，以試劑空白作參比，在Ｕ－３０１０紫外－可見分光光度計上進行波長掃描，并繪制吸光度隨波長變化曲線。確定最大吸收波長后，在該波長下進行顯色液吸光度隨時間變化的試驗。

２結果與分析

２．１不同緩沖溶液下顯色時間

不同緩沖溶液下顯色液開始顯色時間見表１。從表１可以看出，加入ｐＨ低于８．０（ｐＨ ５．０～７．8）的緩沖溶液的顯色液顯色時間緩慢，甚至不顯色，而ｐＨ高于８．０的則顯色較快。同時在試驗過程中觀察發現，顯色緩慢的顯色液的顏色很淺。

２．２不同緩沖溶液下顯色液波長掃描與最大吸收波長

對顯色較慢的未進行波長掃描，ｐＨ ８．０～１０．０的不同緩沖溶液下顯色液波長掃描曲線見圖１，最大吸收波長值見表２。通過圖１、表２可以看出，顯色液在紫外區與可見光區均有最大吸收峰。不同緩沖溶液下顯色液在紫外區的最大吸收波長不一致，在２６８～３１０ ｎｍ之間出現波動變化，而在可見光區最大吸收波長則較一致，除ｐＨ ８．６與９．６ 為６０５ ｎｍ外，其余緩沖體系下最大吸收波長均為６０４ ｎｍ。

２．３不同緩沖溶液下顯色液吸光度隨時間的變化

通過圖２可以看出，不同緩沖溶液下吸光度隨顯色時間的延長表現出不同變化，ｐＨ ８．０、８．２、８．４、８．６緩沖溶液下顯色液吸光度隨時間的延長出現持續上升的趨勢，其他ｐＨ條件下則表現為３０ ｍｉｎ后溶液吸光度呈現穩定的狀態。就實驗的結果來看，２ h內在ｐＨ ９．０～１０．０下的顯色液中形成的配合物穩定。在顯色３０ ｍｉｎ后穩定的顯色液中，從圖中可以看出，ｐＨ ９．０的吸光度最高，在０．３６５附近，其摩爾吸收系數為１．７１７×１０４ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ），靈敏度較高。其次為ｐＨ ９．４和９．２，二者摩爾吸收系數分別為１．２９９×１０４ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ）、１．２３３×１０４ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ）。緩沖液ｐＨ ９．８的吸光度最低，其次為ｐＨ １０．０。

３小結與討論

通過本試驗研究表明，不同緩沖溶液對土壤磷酸酶測定時顯色液吸收波長有一定的影響。ｐＨ值低于８．０的緩沖液不利于溶液的顯色，顯色時間緩慢，ｐＨ ８．０～１０．０的顯色時間快，在紫外區與可見光區分別有最大吸收峰，但紫外區的吸收波長彼此不一致，可見光區的則在６０４ ｎｍ處。不同緩沖溶液下顯色液吸光度隨顯色時間的變化則表明，在ｐＨ ９．０～１０．０下的顯色液中形成的配合物穩定，其中以ｐＨ ９．０的吸光度最高，其摩爾吸光系數為１．７１７×１０４ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ），靈敏度較高。

根據以上結論，結合實驗操作的實際情況，建議在土壤磷酸酶測定過程中，吸取土壤濾液顯色時，加一定體積的緩沖溶液的ｐＨ選擇９．０，同時選擇６０４ ｎｍ波長的光作為光源。

參考文獻：

［１］ 于群英． 土壤磷酸酶活性及其影響因素研究［Ｊ］． 安徽技術師范學院學報，２００１，１５（４）：５－８．

［２］ 關松蔭． 土壤酶及其研究法［Ｍ］． 北京： 農業出版社，１９８７．

［３］ 李振高，駱永明，滕應． 土壤與環境微生物研究法［Ｍ］． 北京：科學出版社，２００８．

［４］ 林先貴． 土壤微生物研究原理與方法［Ｍ］． 北京：高等教育出版社，２０１０．

［５］ 章家恩． 生態學常用實驗研究方法與技術［Ｍ］． 北京：化學工業出版社，２００７．

［６］ 沈桂琴． 土壤中磷酸酶活性的測定方法［Ｊ］．土壤肥料，１９８７（１）：４０－４２．