轉錄因子基因Mfhb-1的表達對苜蓿體細胞胚胎發生過程中營養元素含量的影響

周巖 何男男 魏琦超 張勝利 薛曉鋒 趙俊杰

摘要：Ｍｆｈｂ－１基因是在苜蓿體細胞胚胎發生誘導早期經扣除雜交得到的ＨＤ－Ｚｉｐ Ⅰ類轉錄因子基因，相關研究表明，Ｍｆｈｂ－１基因在苜蓿體細胞胚胎發生誘導的早期可能發揮重要作用。為了進一步探討Ｍｆｈｂ－１基因的生物學功能與營養元素吸收的關系，試驗以經２，４－Ｄ誘導的苜蓿幼嫩葉片的葉肉細胞為材料，利用電感耦合等離子體發射光譜技術，對Ｍｆｈｂ－１基因的正義、反義轉化植株體細胞胚胎發生發育過程中的１０種營養元素含量進行了測定。結果顯示，Ｍｆｈｂ－１基因的表達可能在苜蓿體細胞胚胎發生誘導初期促進了對Ｎａ元素的吸收，同時抑制了對Ｍｇ、Ｚｎ元素的吸收；Ｃｕ、Ｋ、Ｆｅ、Ｍｎ等元素的含量變化可能受Ｍｆｈｂ－１基因表達的影響較小。不過Ｍｆｈｂ－１基因表達與營養元素吸收的關系，以及進而如何影響苜蓿體細胞胚胎發生的詳細分子作用機理等有待于進一步研究。

關鍵詞：苜蓿；Ｍｆｈｂ－１基因；ＨＤ－Ｚｉｐ轉錄因子；體細胞胚胎；營養元素；電感耦合等離子體發射光譜技術

中圖分類號：Ｓ５４１＋．１；Ｑ７８６；Ｑ８１３．７ 文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）06－1165-06

Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｇｅｎｅ Ｍｆｈｂ－１ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｆａｌｃａｔａ

ＺＨＯＵ Ｙａｎ１，ＨＥ Ｎａｎ－ｎａｎ１，２，ＷＥＩ Ｑｉ－ｃｈａｏ１，ＺＨＡＮＧ Ｓｈｅｎｇ－ｌｉ１，ＸＵＥ Ｘｉａｏ－ｆｅｎｇ１，ＺＨＡＯ Ｊｕｎ－ｊｉｅ１

（１． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｈｏｎｇｑｉ Ｆａｒｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｘｔｈ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｒｏｐｓ， Ｃｈａｎｇｊｉ ８３１７０２，Ｘｉｎｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｎａｍｅｄ Ｍｆｈｂ－１ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｆａｌｃａｔａ Ｌ． ｂｙ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ＨＤ－Ｚｉｐ Ｉ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ． Ｒｅｌｅｖａｎｔ ｓｔｕｄｉｅｓ ｈａｄ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ ｃｌｏｓｅｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｏ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍ． ｆａｌｃａｔａ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ｙｏｕｎｇ ｌｅａｆ ｃｅｌｌ ｆｒｏｍ ｓｅｎｓｅ ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｔｅｄ ｂｙ ２，４－Ｄ ｔｏ ｐｒｏｃｅｓｓ ｔｈｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ， １０ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｕｒｖｅｙｅｄ ｂｙ ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＩＣＰ－ＡＥＳ） ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ ｍｏｓｔ ｌｉｋｅｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｎａ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｗｈｉｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｍｇ， Ｚｎ ｅｌｅｍｅｎｔ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍ． ｆａｌｃａｔａ； Aｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ， ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｆｈｂ－１ ｈａｄ ｎｏｔ ｓｈｏｗｅｄ ａｎ ｏｂｖｉｏｕｓ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｃｕ， Ｋ， Ｆｅ ａｎｄ Ｍｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｓｏ ｔｈａｔ ｔｏ ｔａｋｅ ａ ｓｔｅｐ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｉｎｓｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｆａｌｃａｔａ Ｌ．； Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ； ＨＤ－Ｚｉｐ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ； ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏ； ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔ； ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ

苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｆａｌｃａｔａ Ｌ．）是研究植物體細胞胚胎發生的典型模式植物之一，Ｍｆｈｂ－１基因是在苜蓿體細胞胚胎發生誘導早期，經扣除雜交得到的 同源異型域——亮氨酸拉鏈蛋白（Hemeodomain leuzine zipper，HD-Zip）Ⅰ類轉錄因子基因。為了研究該基因的生物學功能，在前期利用正義、反義轉化技術將該基因導入到了苜蓿中，并已得到該基因過量表達和低量表達的轉化植株［１，２］。

轉錄因子對各種功能基因的調控作用可能受到光照、植物激素、低溫等逆境條件的影響。營養元素是植物體內一系列生理生化反應的關鍵輔助因子，因而在參與調控植物早期生長發育及其植物形態構建的過程中發揮著重要作用。前期研究結果顯示，基因的表達可能與苜蓿體細胞胚胎發生過程密切相關［１］，但具體的分子機理尚不清楚。本研究利用電感耦合等離子體發射光譜（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ＩＣＰ－ＡＥＳ）法檢測Ｍｆｈｂ－１基因正義、反義轉化植株體細胞胚胎發生過程中的１０種營養元素含量，以探討Ｍｆｈｂ－１的過量表達或低量表達對苜蓿體細胞胚胎發生過程中營養元素的吸收產生的影響，從而確定在苜蓿體細胞胚胎發生過程中該基因表達與營養元素含量變化的關系，進而為全面揭示Ｍｆｈｂ－１基因作用的分子機理提供相關的研究方法和理論依據。

１材料與方法

１．１植物材料

試驗所用的苜蓿材料共有４ 種，分別是４７／１－５、Ｄ３、Ｆ４、Ｃ５；其中４７／１－５為苜蓿未轉化的材料，作為試驗的對照；Ｄ３、Ｆ４和Ｃ５是以 ４７／１－５為起始材料經轉化得到的轉化體，Ｄ３為攜帶Ｍｆｈｂ－１基因編碼區反向序列的反義轉化植株；Ｆ４為攜帶Ｍｆｈｂ－１ 基因編碼區序列的正義轉化植株；Ｃ５為攜帶全長 Ｍｆｈｂ－１基因，包括編碼區以及該編碼區上游的保守序列開放閱讀框（upstream open reading frames，uORF）序列的正義轉化植株。４ 種苜蓿材料均在ＭＳ固體培養基、２２ ℃、光照時間１６ ｈ／ｄ的條件下進行試驗材料的擴大培養。

參照Ｄｅｎｃｈｅｖ等建立的的苜蓿直接體細胞胚胎發生體系［３］，取培養８～１２ ｄ的植株，剪下靠近頂端的葉片約 １２片，在含有少許 Ｂ５Ｏ培養基的培養皿里切成小塊，然后吸出液體，把切碎的葉片轉入含有４０ ｍＬ Ｂ５Ⅳ（２，４－Ｄ ４．０ ｍｇ／ｍＬ）培養基的１００ ｍＬ三角瓶里，進行液體懸浮振蕩培養，直接誘導其體細胞胚胎發生，誘導時間為１８ ｄ。然后轉入Ｂ５／３ Ｍ培養基中，使前期葉肉細胞懸浮培養物繼續發育，每 １０ ｄ 更換培養基一次，共發育培養３０ ｄ。培養條件為溫度 ２２ ℃、光照時間１６～1８ ｈ／ｄ、轉速為１２０ ｒ／ｍｉｎ。在苜蓿體細胞胚胎發生誘導培養的開始、第五天、第十天、第十五天、第十八天和發育培養的第十天、第二十天、第三十天分別取材，并稱取１ ｇ培養物，３次重復，經液氮速凍后放入超低溫冰箱（－８０ ℃）中保存，待用。

將材料從超低溫冰箱中取出后放入烘箱中，１０５ ℃殺青３ ｈ，８０ ℃烘干至恒重，轉移至瓷坩堝中，用馬弗爐２００ ℃ 炭化１ ｈ、４００ ℃灰化３ ｈ，至灰化完全（無黑色顆粒）后取出冷卻，加 ３ ｍＬ ＨＣｌ－ＨＣｌＯ４（４∶１，體積比）混合液混勻，在電阻板上加熱至完全溶解，定容至１０ ｍＬ。

１．２Ｍｆｈｂ－１基因結構

Ｍｆｈｂ－１基因正義與反義結構如圖１所示，在圖１中，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ２為攜帶Ｍｆｈｂ－１基因編碼區上游的開放閱讀框（ｕＯＲＦ）序列；Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ３為Ｍｆｈｂ－１基因反義編碼區，Ｄ３ 植株攜帶該片段；Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ４為Ｍｆｈｂ－１基因正義編碼區（ＣＤＳ），Ｆ４植株攜帶該片段；Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ５為Ｍｆｈｂ－１基因全長序列（開放閱讀框＋編碼區序列），Ｃ５植株攜帶該片段。

１．３主要試劑與設備

ＨＣｌ、ＨＣｌＯ４、ＨＮＯ３均為分析純，由天津德恩化學試劑有限公司生產；試驗用水均為超純水，由德國ＳＧ公司Ｕｌｔｒａ Ｃｌｅａｒ ＵＶ Ｐｌｕｓ超純水機現制現用。

使用Ｏｐｔｉｍａ ２１００ ＤＶ電感耦合等離子體原子發射光譜儀（美國ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ公司），垂直觀測，觀察位置自動優化；雙陣列背投式固態ＣＣＤ檢測器光學系統、ＲＹＴＯＮ材料霧化器、內置式三通道蠕動泵、４０．６８ ＭＨｚ 自激式固態高頻發生器、空氣切割消除尾焰技術系統、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ循環水冷卻系統等均為實驗室原已具備的儀器。

營養元素標準溶液儲備液為Ｃｕ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｓｅ、Ｃｏ 混合標準液，濃度均為１ ０００ μｇ／ｍＬ（德國默克公司）。將標準儲備液用體積分數為２％ 的 ＨＮＯ３逐級稀釋，Ｃｕ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｓｅ、Ｃｏ等混合標準液按０．００、０．５０、１．００、２．００、４．００、８．００ μｇ／ｍＬ梯度進行配制。

１．４ＩＣＰ－ＡＥＳ工作參數

用ＩＣＰ－ＡＥＳ檢測樣品溶解液中Ｃｕ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｓｅ、Ｃｏ的離子濃度，ＩＣＰ－ＡＥＳ儀器工作參數分別是工作功率１．３ ｋＷ、輔助氣體流量０．２ Ｌ／ｍｉｎ、冷卻氣體流量１５．０ Ｌ／ｍｉｎ、載氣０．８ Ｌ／ｍｉｎ、進樣泵流量１．５ Ｌ／ｍｉｎ，

２結果與分析

２．１分析波長的選擇及背景的校正

ＩＣＰ－ＡＥＳ法對每種營養元素的測定都可以同時選擇多條特征譜線，且具有同步背景校正功能。因此，試驗過程中對每種檢測營養元素同時選取２～３條譜線進行測定，綜合分析強度、干擾情況及穩定性，選擇譜線干擾少、精密度高的分析線。各營養元素的分析波長選擇結果分別是Ｃｕ ３２４．７５ ｎｍ、Ｆｅ ２５９．９３ ｎｍ、Ｚｎ ２１３．８５ ｎｍ、Ｍｎ ２５７．６１ ｎｍ、Ｎａ ５８９．５９ ｎｍ、Ｋ ７６６．４９ ｎｍ、Ｃａ ３１７．９３ ｎｍ、Ｍｇ ２７９．０７ ｎｍ、Ｓｅ １９６．０２ ｎｍ、Ｃｏ ２２８．８５ ｎｍ。

２．２回歸方程和相關系數

按選擇的工作條件檢測各營養元素在配制好的系列梯度濃度的標準品混合溶液下的峰面積，用峰面積（ｙ）對標準液濃度（ｘ，μｇ／ｍＬ）繪制標準工作曲線。各營養元素的線性方程和相關系數見表１。

２．３樣品測定結果

經ＩＣＰ－ＡＥＳ檢測，４種苜蓿材料中Ｃｏ元素和Ｓｅ元素含量的測定結果為負值，低于系統檢出限；其他８種營養元素的測定結果見圖２，其中圖２Ａ為Ｃａ元素的含量動態變化，圖２Ｂ為Ｍｇ元素的含量動態變化，圖２Ｃ為Ｎａ元素的含量動態變化，圖２Ｄ為Ｚｎ元素的含量動態變化，圖２Ｅ為Ｃｕ元素的含量動態變化，圖２Ｆ為Ｋ元素的含量動態變化，圖２Ｇ為Ｆｅ元素的含量動態變化，圖２Ｈ為Ｍｎ元素的含量動態變化。

由４種苜蓿材料體細胞胚胎發生發育過程中各營養元素含量動態變化可以看出，Ｃａ元素在４種苜蓿材料體細胞胚胎發生發育過程中均表現出先下降后上升再下降并保持平穩的變化趨勢，在誘導培養階段的第五天，４種苜蓿材料的Ｃａ元素含量由高到低表現為Ｆ４、４７／１－５、Ｃ５、Ｄ３；在誘導培養后期（１８ ｄ），Ｃ５和Ｆ４的Ｃａ元素含量上升，Ｄ３和４７／１－５的Ｃａ元素含量保持平穩的態勢。

Ｍｇ元素含量在４種苜蓿材料體細胞胚胎發生發育過程中的動態變化較為復雜。在體胚誘導培養階段內，除４７／１－５表現出先下降后上升的趨勢外，Ｄ３、Ｆ４和Ｃ５均表現出先上升后下降的變化，而Ｄ３的峰值在誘導培養階段的第十天出現，早于Ｃ５的第十五天，也早于F4的發育培養階段第十天。Ｍｇ元素含量在發育培養階段的初期（發育培養１０ ｄ）還有一個高峰出現，此時４種苜蓿材料的Ｍｇ元素含量由高到低分別為Ｆ４、Ｃ５、４７／１－５、Ｄ３。

Ｎａ元素含量在４種苜蓿材料體細胞胚胎發生發育過程中的變化波動較為復雜，Ｆ４和４７／１－５大致表現為在誘導培養階段的第五天有一個高峰，然后下降，最后在發育培養階段的末期有一個小幅上升；Ｃ５的Ｎａ元素含量在誘導培養階段峰值出現前有一個下降的過程，誘導培養的第五天開始迅速上升，誘導培養的第十天達峰值后開始下降，在發育培養階段表現出與Ｆ４和４７／１－５類似的變化趨勢；Ｄ３的Ｎａ元素含量在誘導培養階段一直增加，在發育培養階段開始后才表現出下降趨勢。

Ｚｎ元素含量在４種苜蓿材料體細胞胚胎發生發育過程中的變化十分明顯，除了Ｄ３的峰值出現在誘導培養階段的第十天外，其他３種材料的峰值均出現在誘導培養階段的第十五天，４種材料在誘導培養階段的Ｚｎ元素含量峰值由高到低分別為Ｄ３、Ｃ５、４７／１－５、Ｆ４。而在發育培養階段開始后，4種苜蓿材料的Ｚｎ元素含量基本上一直處于很低的水平，并且保持平穩。

Ｃｕ元素含量在４種苜蓿材料體細胞胚胎發生發育過程中的變化跌宕起伏，Ｆ４、Ｃ５、４７／１－５、Ｄ３都表現為在誘導培養階段先下降后上升再下降的變化趨勢；進入發育培養階段后，都是先上升后下降；以４７／１－５材料的Ｃｕ元素含量最高，峰值出現在誘導培養階段的第十五天；其次是Ｃ５材料，Ｃｕ元素含量峰值出現在誘導培養階段的第十天；第三是Ｄ３材料，Ｃｕ元素含量峰值出現在發育培養階段的第十天；而Ｆ４材料的Ｃｕ元素含量峰值出現在誘導培養階段的第十五天。到發育培養階段結束前１０ ｄ（發育培養２０ ｄ），４種材料的Ｃｕ元素含量都處在最低值，并且一直維持到發育培養階段結束。

Ｋ元素含量在４種苜蓿材料體細胞胚胎發生發育過程中基本上處于下降的趨勢，４種材料的Ｋ元素含量峰值大都沒有超過誘導培養階段的起始水平；到發育培養階段結束時（發育培養３０ ｄ），４種苜蓿材料的Ｋ元素含量由高到低分別為４７／１－５、Ｆ４、Ｃ５、Ｄ３。

Ｆｅ元素含量在苜蓿４種材料體細胞胚胎發生發育過程中的變化起伏很大，在發育培養階段結束前１０ ｄ（發育培養２０ ｄ），與Ｃｕ元素含量的變化趨勢基本一致，4種材料的Fe元素含量大都處在最低值；但在發育培養２０ ｄ后，４種材料的Ｆｅ元素含量出現了戲劇性的變化，其含量水平大幅上升，最后都超過了前面水平，達到了峰值，此時４種苜蓿材料的Ｆｅ元素含量由高到低分別為Ｃ５、４７／１－５、Ｄ３、Ｆ４。

Ｍｎ元素含量在４種苜蓿材料體細胞胚胎發生發育過程中的變化趨勢和Ｚｎ元素正好相反，其在誘導培養階段基本上都處在較平穩的狀態，而一進入發育培養階段，４種材料的Ｍｎ元素含量立即大幅度上升，峰值出現在發育培養階段的第十天，而后迅速下降，到發育培養階段結束時，又恢復到誘導培養階段的水平。４種材料的Ｍｎ元素含量達峰值時由高到低的排序為Ｆ４、Ｄ３、４７／１－５、Ｃ５。

３討論

３．１Ｍｆｈｂ－１基因的表達對苜蓿體細胞胚胎發生發育的影響

苜蓿４種材料體細胞胚胎發生發育的顯微觀察［４，５］顯示，在誘導培養階段的第十天，Ｆ４和４７／１－５的表面會形成一些突起結構；在第十五天時，Ｄ３和Ｃ５表面才出現微小的突起結構。在發育培養階段，Ｄ３和Ｃ５的表面白色組織增多，且培養液渾濁不清，在發育培養的第三十天時，觀察到Ｆ４培養物中出現一些小的子葉胚，而其他３種材料多是魚雷胚。在發育培養的第二十八天時，統計４種材料的體細胞胚胎數目，由高到低依次為Ｆ４、４７／１－５、Ｃ５、Ｄ３。上述結果表明，Ｍｆｈｂ－１基因編碼區的表達可能促進了苜蓿體細胞胚胎胚性細胞的誘導，從而促進了苜蓿體細胞胚胎的發生，而ｕＯＲＦ的表達可能對該基因的表達有一定的抑制作用。

３．２Ｍｆｈｂ－１基因的表達對苜蓿體細胞胚胎發生發育過程中營養元素含量的影響

Ｍｆｈｂ－１基因的表達可能促進了苜蓿對Ｃａ元素的吸收。由圖２Ａ可以看出，在苜蓿體細胞胚胎發生發育進行誘導培養的第五天，４種材料的Ｃａ元素含量由高到低依次為Ｆ４、４７／１－５、Ｃ５、Ｄ３，這與苜蓿體細胞胚胎發生發育情況和最后（發育培養的第二十八天［4，5］）體細胞胚胎數量所觀察到的排序結果相吻合。在誘導培養后期，Ｆ４和Ｃ５的Ｃａ元素含量上升，Ｄ３和４７／１－５的Ｃａ元素含量保持平衡，說明Ｃａ元素對胚性細胞的形成可能有一定的促進作用，由此可推測Ｍｆｈｂ－１基因的表達可能促進了苜蓿體細胞胚胎誘導后期階段對Ｃａ元素的吸收。

Ｍｆｈｂ－１基因的表達可能促進了苜蓿對Ｍｇ元素的吸收。圖２Ｂ表明，Ｍｇ元素含量在苜蓿體細胞胚胎發生發育過程中的變化較為復雜。除４７／１－５表現出先下降后上升的趨勢外，Ｄ３、Ｆ４和Ｃ５均表現出先上升后下降的趨勢，而Ｄ３的峰值在誘導培養階段的第十天出現，早于Ｃ５的第十五天，也早于F4的發育培養階段第十天。在發育培養的初期，４種材料的Ｍｇ元素含量由高到低表現為Ｆ４、Ｃ５、４７／１－５、Ｄ３，并且與最后所觀察到的體細胞胚胎數目排序情況類似［４］；由此可推測Ｍｆｈｂ－１ 基因的表達可能促進了苜蓿對Ｍｇ元素的吸收。

Ｍｆｈｂ－１基因的表達可能促進了苜蓿對Ｎａ元素的吸收。圖２Ｃ揭示，Ｎａ元素含量在苜蓿體細胞胚胎發生發育過程中變化波動較為復雜，在誘導培養階段的第五天，除了Ｃ５的Ｎａ元素含量呈下降趨勢外，其他３種材料的Ｎａ元素含量均呈上升趨勢，其中Ｆ４上升的最迅速；該現象可能是由于ｕＯＲＦ的表達而導致Ｃ５的Ｎａ元素含量峰值較Ｆ４與４７／１－５ 滯后。結合體細胞胚胎發生發育觀察結果［４］，可以推測Ｍｆｈｂ－１基因的過量表達可能在苜蓿體細胞胚胎發生誘導的初期，就促進了苜蓿對Ｎａ元素的吸收。

Ｍｆｈｂ－１基因的表達可能抑制了苜蓿對Ｚｎ元素的吸收。由圖２Ｄ可以觀察到，Ｚｎ元素含量在苜蓿體細胞胚胎發生發育過程中的變化十分明顯，除了Ｄ３的峰值出現在誘導培養階段的第十天外，其他３種材料的峰值均出現在誘導培養階段的第十五天，且４種材料在誘導培養階段Ｚｎ元素含量峰值由高到低表現為Ｄ３、Ｃ５、４７／１－５、Ｆ４，與最后的體細胞胚胎數目統計結果呈反比關系。由此表明，高含量的Ｚｎ元素可能不利于苜蓿胚性細胞的分化，由此可推測Ｍｆｈｂ－１基因的表達在苜蓿體細胞胚胎發育培養階段初期就可能抑制了對Ｚｎ元素的吸收。

在４７／１－５、Ｄ３、Ｆ４和Ｃ５這４種材料中，Ｃｕ元素、Ｋ元素、Ｆｅ元素、Ｍｎ元素含量在苜蓿體細胞胚胎誘導和發育過程中的變化大體趨于一致，表明 Ｍｆｈｂ－１基因的過量或低量表達，對Ｃｕ、Ｋ、Ｆｅ、Ｍｎ元素的含量變化影響不明顯。

３．３主要營養元素對體細胞胚胎發生發育的影響

目前對營養元素在體細胞胚胎發生發育中的具體生物學功能的研究較少，主要集中在與體細胞胚胎發育模式相似的合子胚上。如許淑蘋［６］在研究杉木［Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook］合子胚的發育時發現，Ｃｕ元素的含量在合子胚發育進程中呈小幅上升變化；Ｐ元素含量總體上呈較大幅度上升；Ｋ、Ｍｎ、Ｃａ元素含量呈先下降后上升的變化；Ｍｇ元素含量在體胚發育的后期呈持續上升趨勢，而后達到最高值；Ｃｏ和Ｎｉ元素含量較低，Ｃｏ元素的含量不超過 １ μｇ／ｇ，Ｎｉ元素的含量不超過３ μｇ／ｇ。甄艷等［７］在研究濕地松（Pinus elliottii Engelmann）×加勒比松（P. caribaea Morelet）的雜種合子胚發育過程中，發現Ｍｎ、Ｎｉ、Ｂ、Ｎａ、Ａｌ和Ｋ元素在胚胎發育早期的合子胚中含量最高；Ｐ、Ｍｇ和Ｆｅ元素呈相似的變化趨勢，在發育開始后先小幅下降而后隨胚發育逐漸上升；Ｃａ元素在合子胚發育早期的含量較高，隨后下降，而后大幅度上升，在合子胚發育后期達到最大值。本研究發現，對照材料４７／１－５的體胚發育培養１０ ｄ后，Ｋ、Ｎａ元素含量隨著胚胎的發育不斷升高；Ｚｎ元素含量總體變化不大；Ｃａ、Ｃｕ、Ｆｅ元素含量峰值均出現在體細胞胚胎誘導或發育的中間階段，Mg元素含量峰值出現在體胚誘導末期；Mn元素含量峰值出現在體胚發育初期。

已有研究發現，高濃度的鈉離子可以使蛋白變性，也可以影響細胞質中蛋白質的功能［８］。液泡缺少鈉離子將會削弱酶的功能，也會限制生長發育。擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）ａｔｒａｂ２８基因在胚胎形成后期表達，它編碼的核內靶蛋白可以增加胚胎形成后期的陽離子容量，當該蛋白在擬南芥中過量表達時還可以促進擬南芥萌芽的發生［８］。鈣離子對于調節植物滲透壓扮演著重要的角色，不同的植物細胞對鈣離子存在不同的響應，一般情況下，鈣離子在細胞信號傳導過程中起到中心作用［９］，如在組織培養中，鈣離子的濃度變化體系中含有大量胚胎表達的鈣離子依賴蛋白激酶［１０］。鐵是植物生長發育所必需的元素，主要作為結構螯合物或金屬蛋白存在于植物組織中，常參與氧化還原反應，然而鐵的不溶性限制了它的吸收；通過細胞質膜三磷酸腺苷酶的細胞外酸化，可以幫助將鐵泵進細胞內，鐵被膜還原酶還原成二價鐵離子，然后轉運進細胞內［１１］。黃立皓［１２］研究發現，Ｃｕ、Ｆｅ和Ｍｇ離子含量的增加可以提高愈傷組織中細胞的滲透勢，促進細胞中遺傳物質的形成，從而提高愈傷組織分化率。Ｐｒｉｙａｎｋａ等［１３］在研究卵葉車前（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｏｖａｔａ Ｆｏｒｓｓｋ）體胚與非胚性愈傷組織中營養元素含量時發現，高含量的Ｋ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｃｕ和Ｚｎ是體胚形成的關鍵因素。本研究發現，在對照材料４７／１－５體細胞胚胎的發育過程中（轉入發育培養基１０ ｄ之后），體細胞胚胎發育培養物中的Ｋ、Ｎａ元素含量不斷上升，表明Ｋ、Ｎａ元素在苜蓿體胚的發育成熟過程中可能起重要的作用。

綜上所述，Ｍｆｈｂ－１基因的表達與苜蓿體細胞胚胎發生發育過程中多種營養元素含量的變化有著密切的關系。該基因的表達可能在體細胞胚胎發生發育過程的不同階段，通過促進植物體細胞胚胎誘導材料對營養元素的吸收（如在體細胞胚胎誘導前期促進Ｎａ元素的吸收），同時抑制對另一些營養元素的吸收（如在體細胞胚胎誘導前期對Ｍｇ、Ｚｎ元素的吸收），或者通過影響這些營養元素含量的變化趨勢或模式，從而參與調節體細胞胚胎發生進程中各類基因群的表達，以及一系列相應的生理生化反應，進而達到調控苜蓿體細胞胚胎發生發育過程的作用。但營養元素含量與Ｍｆｈｂ－１基因表達在苜蓿體細胞胚胎發生發育過程中的相互關系，以及詳細的分子作用機理還有待進一步探討。

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