指紋圖譜技術在云南省烤煙質量分類中的應用研究

唐徐紅 矣躍平 袁仕信 何云燕 劉磊 尹曉東 曹林海 何結望 李琳 涂書新

摘要：選擇合適的方法對煙葉質量進行科學合理的分類，對于指導烤煙配方打葉工作及提高卷煙質量具有重要意義。試驗采用高效液相色譜指紋圖譜技術，結合化學計量學分析方法，建立了云南省１５個典型煙葉產區Ｃ３Ｆ等級煙葉基于指紋圖譜特征的煙葉質量分類方法。結果表明，２０１０年收獲的云南省典型煙葉產區的煙葉質量可分成４個基本類型，一類產區包括富源縣、沾益縣、馬龍縣和大姚縣，二類產區包括宣威市、祿勸縣、保山市、麗江市和景東縣，三類產區包括麒麟區、羅平縣、紅河縣和文山縣，四類產區包括臨滄市和昭通市。試驗研究結果顯示，煙葉指紋圖譜作為煙葉質量控制的新方法，可以減少評吸師的工作量，提高配方打葉的工作效率。

關鍵詞：指紋圖譜；烤煙；品質；分類；云南省

中圖分類號：Ｏ６５７．７＋３；Ｓ５７２；ＴＳ２０７．７（２７４）文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）06－1156-05

Application of Fingerprint Technology in Quality Classification of Flue-Cured Tobacco in Yunnan Province

ＴＡＮＧ Ｘｕ－ｈｏｎｇ１，ＹＩ Ｙue－ｐｉｎｇ２，ＹＵＡＮ Ｓｈｉ－ｘｉｎ２，ＨＥ Ｙｕｎ－ｙａｎ２，ＬＩＵ Ｌｅｉ２，ＹＩＮ Ｘｉａｏ－ｄｏｎｇ２，ＣＡＯ Ｌｉｎ－ｈａｉ１，

ＨＥ Ｊｉｅ－ｗａｎｇ３，ＬＩ Ｌｉｎ３，ＴＵ Ｓｈｕ－ｘｉｎ１

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｙｕｎｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ ｏｆ Ｔｏｂａｃｃｏ， Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２１８， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｔｏｂａｃｃｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． ｏｆ Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｗｕｈａｎ ４３００５１， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ ｒａｔｉｏｎａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ flue-cured ｔｏｂａｃｃｏ ｑｕａｌｉｔｙ ｗａｓ ｏｆ ｇｒｅａｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｆｏｒ ｇｕｉｄｉｎｇ ｏｆ flue-cured ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｆ ｂｌｅｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ａ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｖｅｓ， ｇｒａｄｅ Ｃ３Ｆ， ｆｒｏｍ １５ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｒｅａｓ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ＨＰＬＣ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ４ ｇｒｏｕｐｓ， ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｃｌａｓｓ ｏｆ ａｒｅａｓ ｉｎｃｌｕｄed Ｆｕｙｕａｎ ｃｏｕｎｔｙ， Ｚｈａｎｙｉ ｃｏｕｎｔｙ， Ｍａｌｏｎｇ ｃｏｕｎｔｙ ａｎｄ Ｄａｙａｏ ｃｏｕｎｔｙ， ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｃｌａｓｓ ｏｆ ａｒｅａｓ ｉｎｃｌｕｄed Ｘｕａｎｗｅｉ ｃｉｔｙ， Ｌｕｑｕａｎ ｃｏｕｎｔｙ， Ｂａｏｓｈａｎ ｃｉｔｙ， Ｌｉｊｉａｎｇ ｃｉｔｙ ａｎｄ Ｊｉｎｇｄｏｎｇ ｃｏｕｎｔｙ， ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｃｌａｓｓ ｏｆ ａｒｅａｓ ｉｎｃｌｕｄed Ｑｉｌｉｎ ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｌｕｏｐｉｎｇ ｃｏｕｎｔｙ， Ｈｏｎｇｈｅ ｃｏｕｎｔｙ ａｎｄ Ｗｅｎｓｈａｎ ｃｏｕｎｔｙ， ｔｈｅ ｆｏｕｒｔｈ ｃｌａｓｓ ｏｆ ａｒｅａｓ ｉｎｃｌｕｄed Ｌｉｎｃａｎｇ ｃｉｔｙ ａｎｄ Ｚｈａｏｔｏｎｇ ｃｉｔｙ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｗｏｒｋｌｏａｄ ｏｆ ｓｍｏｋｉｎｇ ｖａｌｕａｔｏｒ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｌｅａｆ ｂｌｅｎｄｉｎｇ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ； ｆｌｕｅ－ｃｕｒｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ； ｑｕａｌｉｔｙ； classification； Ｙｕｎｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ

云南省具有種植煙草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）得天獨厚的條件，生產出的烤煙色澤橘黃、香氣濃郁、吸味醇和、品質優良，是中式卷煙的主體原料［１］。但是，由于云南省地理特征和氣候變化較大，不同地區的煙葉風格存在著顯著的差異；當地煙葉公司為了對煙葉質量進行控制，為卷煙生產企業提供更多的質量穩定的煙葉原料，需要在對煙葉質量進行合理分類的基礎上實行烤煙配方打葉工作。

長期以來，煙葉品質的評價和分類是采用感官評吸和化學分析等方法進行的。然而，人工評吸工作量大，勞動強度高，且結果受主觀因素影響大，重復性差，并不適合在大規模生產上應用。而常規化學成分檢測通常是煙葉質量判斷的輔助手段［２，３］，如鉀氯比只能表明煙葉的燃燒性，施木克值只能描述烤煙和香料煙的吃味品質，糖酸比僅能反映烤煙的香氣風格和香氣品質，氮堿比反映煙氣的濃度、吃味，糖堿比用來判斷煙氣的柔和性和香味。由于煙草是一種植物原料，化學成分非常復雜，煙葉香氣品質中已鑒定的成分就高達５ ０００種以上。顯然，單靠測定某一種或某些化學成分很難對煙葉質量進行有效的評價。

指紋圖譜系指將分析對象經適當處理后，采用一定的儀器分析手段得到的、能夠標示該對象特性的共有峰圖譜。指紋圖譜技術具有模糊指紋特征分析、宏觀推斷分析等特點，是進行復雜物質質量評價的有效手段［４，５］。指紋圖譜技術已經被成功地應用于中藥品質分析和判斷及農產品溯源等領域。近年來，一些研究者對指紋圖譜技術在煙草科研與生產上應用的理論和實踐問題也進行了有益的探索［４－７］。課題組自２００５年以來一直開展應用烤煙指紋圖譜技術判斷烤煙品質的研究，并建立了烤煙醇化品質判定的高效液相指紋圖譜分析方法［８－１０］。

過去的研究證明了烤煙指紋圖譜技術是解決烤煙品質評價復雜問題的有效手段，但烤煙指紋圖譜技術應用于烤煙配方打葉質量控制的研究與應用尚未見報道。本研究的目的是在建立云南省不同品質煙葉的指紋圖譜數據庫的基礎上，應用化學計量學的方法對指紋圖譜進行表征，探討指紋圖譜技術在烤煙配方打葉中的應用途徑和方法，從而為烤煙生產質量控制、煙葉生態類型劃分和提高配方打葉的穩定性提供理論基礎。

１材料與方法

１．１材料

供試煙葉品種為 Ｋ３２６（Ｎ． ｔａｂａｃｕｍ Ｌ． ｃｖ． Ｋ３２６），等級為Ｃ３Ｆ，２０１０年分別取自云南省１５個不同的煙葉產區，包括富源縣、沾益縣、大姚縣、馬龍縣、麗江市、麒麟區、祿勸縣、紅河縣、臨滄市、宣威市、景東縣、羅平縣、保山市、文山縣、昭通市。所有煙樣在２０１０年采樣收集后，經云南省煙草煙葉公司統一復烤后制成煙絲。將煙絲樣品在６０ ℃下烘干，用植物粉碎機粉碎，過６０目篩，將煙末用塑料袋密封，置于超低溫冰箱（－８０ ℃）中保存待測。

１．２指紋圖譜數據庫的建立

稱取０．６ ｇ煙末，加入２０ ｍＬ甲醇。在溫度２５ ℃、頻率為４０ ＭＨｚ的超聲波儀器中超聲６０ ｍｉｎ。離心機上離心（１０ ０００ g）８ ｍｉｎ，離心后取上清液過０．４５ μｍ的濾膜，取濾液為樣品待測溶液。

采用Ａｇｉｌｅｎｔ ＯＤＳ Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ）色譜柱，流動相Ａ為乙腈，流動相Ｂ為０．１％甲酸。梯度洗脫程序：０ ｍｉｎ，Ａ與Ｂ體積比０∶１００；３０ ｍｉｎ，體積比４０∶６０；４５ｍｉｎ，體積比５０∶５０；５５ ｍｉｎ，體積比６０∶４０，保持５ ｍｉｎ；然后６５ ｍｉｎ，體積比０∶１００，保持２ ｍｉｎ后運行５ ｍｉｎ。體積流量為５ ｍＬ／ｍｉｎ，柱溫２５ ℃，檢測波長２５０ ｎｍ。

１．３化學測定方法及數據統計分析

水溶性總糖及還原糖的測定采用文獻［１１］的方法。煙堿的測定采用文獻［１２］的方法。應用ＳＡＳ ８．０軟件進行主成分分析、簡單相關分析、復相關分析，用類平均法進行聚類分析。采用Ｅｘｃｅｌ ２００３軟件進行做圖分析。用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統Ａ版對指紋圖譜進行相似度評價。

２結果與分析

２．１云南省烤煙的指紋圖譜及其主成分分析

不同代表性的樣品其指紋圖譜數據有機聯系放置在一起即構成指紋圖譜數據庫。圖１是試驗獲得的云南省典型煙葉產區烤煙ＨＰＬＣ共有峰指紋圖譜。根據共有峰確定原則，在不同產區C3F等級煙葉中確定的甲醇提取物指紋圖譜共有４８個峰（數據未列）。

主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ cｏｍｐｏｎｅｎｔ aｎａｌｙｓｉｓ，ＰＣＡ）是在信息量損失最小的情況下對數據進行壓縮、通過線性變化從多個變量中選擇數量較少的重要變量的過程。由于指紋圖譜特征峰高達數百個，不便于進行化學計量學分析，因此試驗利用主成分分析方法，設法將原來的變量重新組合成一組新的互相無關的若干個綜合變量，同時根據實際需要從中取出幾個較少的綜合變量并能盡可能多地反映出原來變量的信息。試驗將從指紋圖譜分時數據庫選取的１１組特征峰（分時特征峰的時間范圍分別是０～３ ｍｉｎ、３～６ ｍｉｎ、９～１２ ｍｉｎ、２１～２４ ｍｉｎ、３６～３９ ｍｉｎ、３９～４２ ｍｉｎ、４２～４５ ｍｉｎ、４８～５１ ｍｉｎ、５１～５４ ｍｉｎ、５４～５７ ｍｉｎ、５７～６０ ｍｉｎ）進行主成分分析，結果見表１和表２。從表１可見，前３個主成分的累計方差貢獻率就已達到了９１．５0％，基本上能反映出指紋圖譜包含的信息。因此將這３個主成分指標作為指紋圖譜新的變量進行下一步的分析，從而達到降維的目的，這在很大程度上降低了數據分析的工作量。表２結果表明，主成分１的顯著特征因子包括３、４、５、６、７、８、９、１０、１１組特征峰，主成分２的顯著特征因子包括３、４組特征峰；主成分３的顯著特征因子包括１、２組特征峰。

２．２云南省典型煙葉產區烤煙的化學品質

云南省１５個不同煙葉產區在２０１０年取樣測定的C3F等級煙葉重要化學品質成分指標結果見表３，表中按煙葉煙堿含量從低到高排序，表３的結果表明，富源縣、沾益縣、大姚縣和馬龍縣４個產區的煙葉煙堿含量處于云南省各產區的較低水平，煙堿含量在２％以下，而總糖、還原糖和糖堿比處于較高的水平，使得糖堿比在１８以上。與之相反，保山市、文山縣和昭通市３個產區的煙堿含量處于較高水平，達３％以上，相應地，其總糖、還原糖和糖堿比處于較低水平，糖堿比在１０以下。其他產區的煙堿含量介于上述二者之間。

將主成分得分值與煙葉常規化學成分進行相關性分析，結果見表４。由表４可知，煙堿與主成分２呈極顯著的正相關，與主成分３呈極顯著的負相關，與主成分值之間的復相關達到了極顯著水平；總糖含量與主成分１、主成分２呈顯著的負相關，與主成分值之間的復相關達到了極顯著水平；糖堿比與主成分１、主成分２呈極顯著的負相關，與主成分３呈極顯著的正相關，與主成分值之間的復相關達到了極顯著水平。

２．３應用指紋圖譜的聚類分析對云南省烤煙品質進行分類

以指紋圖譜特征峰主成分值為參數，對云南省２０１０年１５個煙葉產區C3F等級煙葉樣品進行聚類分析，結果見圖２。圖２表明，在距離值為０．１左右時，２０１０年云南省不同產區Ｃ３Ｆ等級煙葉可分成４類。第一類為麒麟區、麗江市、馬龍縣和大姚縣；第二類是沾益縣、富源縣；第三類是臨滄市、羅平縣、紅河縣、景東縣、祿勸縣和宣威市；第四類是保山市、文山縣、昭通市。

比較圖２的聚類結果和表３的化學品質成分可以看出，聚類分析的結果與烤煙化學成分含量具有密切的聯系，結合高效液相色譜指紋圖譜技術與化學計量學分析方法，可建立云南省１５個典型煙葉產區Ｃ３Ｆ等級煙葉基于指紋圖譜特征的煙葉質量分類方法。其中，一類產區包括富源縣、沾益縣、馬龍縣和大姚縣，該產區煙堿含量范圍是１．２７％～１．６３％，總糖、還原糖含量范圍分別是２７．３２％～３６．１５％、２３．５４％～２８．７７％，糖堿比范圍是１８．２７～２８．５３；二類產區包括宣威市、祿勸縣、保山市、麗江市和景東縣，該產區煙堿含量范圍是２．０４％～２．２６％，總糖、還原糖含量范圍分別是３０．３５％～３５．８７％、２４．２０％～３２．０３％，糖堿比范圍是１３．８５～１７．６２；三類產區包括麒麟區、羅平縣、紅河縣和文山縣，該產區煙堿含量范圍是２．２９％～３．００％，總糖、還原糖含量范圍分別是２６．１１％～３２．０２％、２３．４７％～２５．９１％，糖堿比范圍在１０．５５～１１．７７。四類產區包括臨滄市和昭通市。該產區煙堿含量是３．５１％和３．９１％，總糖、還原糖含量范圍分別是２０．８６％和２６．３３％、２０．２３％和２１．５６％，糖堿比是５．９５和６．６９。

３小結與討論

不同品質或來源煙葉的差異性本質上來源于內在的化學成分組成或比例的不同。通過烤煙指紋圖譜特征峰的定量比較，可以判斷煙草品質及其來源。因此，指紋圖譜技術可以直接用于煙葉質量控制的定量研究。由于指紋圖譜分時特征峰仍是多元數據，在指紋圖譜定量研究方面工作量比較大，也比較繁瑣。從定量應用的角度考慮，需要有能夠反映信息權重的綜合指標值為代表，從整體上反映指紋圖譜，而主成分分析法可以完成此類任務。試驗通過指紋圖譜主成分分析可以看出，前３個主成分的方差貢獻率達到了９１．５0％，基本上能反映指紋圖譜的總體信息。相關性分析顯示，前３個主成分與煙葉中煙堿、總糖和糖堿比達到了顯著或極顯著的相關性，可見指紋圖譜主成分可以用來對煙葉進行質量控制。類似的研究報道有，赫炎等［１３］采用主成分分析結合指紋圖譜進行制南星飲片質量的控制方法；萬益群等［１４］基于白酒ＨＰＬＣ指紋圖譜，采用主成分分析、聚類分析和人工神經網絡等統計方法，為白酒樣品的鑒別提供了一個新的技術手段，也為白酒的質量控制提供了科學依據；劉江等［１５］通過麥冬ＨＰＬＣ指紋圖譜進行主成分－聚類分析，建立的模式識別模型結果可靠，為麥冬質量評價和質量分類提供了有效依據。

聚類分析的基本思路是用“物以類聚”來衡量樣品之間的親疏程度，可廣泛地用于各類物質包括中草藥進行質量分類和鑒別［１６－１８］。試驗通過指紋圖譜特征峰聚類結果可以看出，不同類別之間煙葉的質量風格類型存在著顯著的差別，同一類別之間煙葉中的化學成分穩定性較好。通過相同等級的指紋圖譜再分級結果，可以使企業清楚了解煙葉的內在品質和等級結構，有利于從整體上設計配方，提高配方打葉的質量和純度，且能充分有效地利用煙葉資源。

試驗采用系統聚類方法［19］，對云南省典型煙葉產區烤煙HPLC指紋圖譜分時數據庫中選取的１１組特征峰多變量指標進行了聚類分析，其中距離的測定方法是類平均差法。結果顯示，該方法可以將不同產區不同風格的煙葉進行有效的分類評價，能夠客觀反映煙葉的內在質量。不同產區之間的聚類結果表明，煙堿、總糖、還原糖和糖堿比等煙葉中化學品質成分指標在同一類別中結果相近，這將有效地降低因產區間氣候條件帶來的煙葉質量差異，從而提高配方打葉的穩定性。本研究還對不同年份、不同產區及不同等級煙葉的分類結果進行了比較（待發表），發現雖然產區內各年份煙葉由于氣候條件和農藝措施導致煙葉質量出現變化，但通過對不同產地、不同部位煙葉的指紋圖譜特征峰進行聚類分析和綜合評價，可以找到在化學成分組成方面真正相近的煙葉，這將為配方打葉技術提供理論依據。

當然，指紋圖譜技術在煙葉品質判斷和分類的研究還處于起步階段，指紋圖譜數據庫的應用還存在嚴重不足，對烤煙質量的評價還缺乏規范和統一的分析方法，這對指紋圖譜技術在煙草業上的推廣和應用構成了一定的障礙。指紋圖譜包含的潛在信息量非常大，也包含有雜質或與指紋圖譜研究無關的信息，因此信息的整理、濾除無用的信息、保留原始特征信息也是指紋圖譜研究的難點和重點。指紋圖譜具有模糊性和整體性的特性，對指紋圖譜的評價應是對整體內容的綜合性分析，但目前的研究缺乏一個綜合的評價指標。另外，目前烤煙指紋圖譜的特征峰對評吸指標和風格特點的影響研究較少。通過了解特征峰的作用和影響，將為特征峰的解析提供研究方向和目標。

采用主成分分析方法可將云南省典型煙葉產區烤煙HPLC指紋圖譜分時數據庫中１１組特征峰分成３個主成分，其特征方差貢獻率總計達到了９１．５０％。指紋圖譜技術包含有先進的儀器分析與信息技術，采用指紋圖譜特征峰的聚類分析，可對不同產區煙葉的質量和風格進行分類。分類結果與烤煙化學成分指標，如煙堿、總糖和糖堿比具有密切的關系，這表明應用指紋圖譜技術進行烤煙品質分類具有科學性和可操作性。

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