RP-HPLC測(cè)定撥云錠中龍膽苦苷的含量

袁文娟 高文分

摘 要：目的：建立撥云錠中龍膽苦苷含量測(cè)定方法。方法：采用Agilent ZORBAX SB C18柱（250 mm×46 mm,5 μm）為色譜柱，流動(dòng)相：甲醇-水（30∶70），流速10 ml?min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm。結(jié)果：龍膽苦苷的線性范圍為01624 μg ~16240 μg，r＝09999，平均加樣回收率（n＝6）為9879%，RSD為057% 。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于撥云錠的質(zhì)量控制 。

關(guān)鍵詞：撥云錠；龍膽苦苷； RP-HPLC

中圖分類號(hào)：R2841

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-2349（2012）06-0061-02

撥云錠是衛(wèi)生部頒布的國(guó)家基本藥物，由爐甘石（煅）、龍膽浸膏、冰片、麝香等10味中藥組成，具有明目退翳，解毒散結(jié)，消腫止痛之功效。用于暴發(fā)火眼，目赤腫痛，痧眼刺痛，目癢流淚，翼狀胬肉，白內(nèi)障，牙齦腫痛，喉舌紅腫［1］。適用于沙眼，瞼緣炎，麥粒腫，急性結(jié)膜炎，慢性結(jié)膜炎，過(guò)敏性角膜炎，化膿性角膜炎，角膜云翳。有研究表明：撥云錠具有廣譜抗菌作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌，白葡菌，甲、乙型鏈球菌的抗菌活力最強(qiáng)，低濃度呈較強(qiáng)的抑菌作用，高濃度呈現(xiàn)殺菌作用［2］。該藥對(duì)動(dòng)物的在體試驗(yàn)—家兔試驗(yàn)性角膜潰瘍也呈現(xiàn)相同的作用［3］。撥云錠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中缺少含量測(cè)定項(xiàng)，藥品內(nèi)在質(zhì)量難以評(píng)定，本文建立了HPLC方法測(cè)定藥品中龍膽苦苷的含量，為撥云錠的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

Agilent1100高效液相色譜儀,帶四元泵；VWD可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器；自動(dòng)進(jìn)樣器；在線真空脫氣機(jī)；智能化柱溫箱及HP化學(xué)工作站；甲醇為HPLC級(jí)，水為超純水。龍膽苦苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所 含量測(cè)定用，批號(hào)：110770-200712）。六批撥云錠樣品均由云南老撥云堂藥業(yè)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

21 溶液的制備 對(duì)照品溶液：精密稱取龍膽苦苷對(duì)照品適量，加甲醇制成 0050 mg?mL-1的對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取重量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，混勻，取約028 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率250 W，頻率33 KHz）15 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，取上清液，用微孔濾膜（045 μm）濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

陰性樣品溶液：按處方比例制成不含龍膽浸膏的撥云錠陰性樣品，按供試品溶液制備方法，制成陰性樣品溶液。

22 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18柱 (46×250 mm 5 μm)； 流動(dòng)相：甲醇-水（30∶70）；流速：10 mL?min-1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：10 μL；外標(biāo)法。在此色譜條件下，龍膽苦苷與其它成分均能達(dá)到基線分離，撥云錠中的其它成分對(duì)龍膽苦苷的含量測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

a 對(duì)照品；b 樣品；c 陰性樣品；1 龍膽苦苷

圖1 撥云錠HPLC色譜圖

23 線性關(guān)系考察 精密稱取龍膽苦苷對(duì)照品適量，置量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再以甲醇稀釋至一系列濃度的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖，以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）作回歸統(tǒng)計(jì)，得回歸方程為Y=110793X+688，r= 09999（n=10），線性范圍為01624 μg~16240 μg。

24 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取取供試品溶液分別在0，2，4，8，14 h進(jìn)樣，測(cè)得龍膽苦苷的峰面積， RSD為029％；表明樣品溶液在14 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

25 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得龍膽苦苷的峰面積，其峰面積的RSD分別為038％。表明儀器的精密度良好。

26 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)撥云錠樣品，平行制備6份供試品溶液，按“21”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別測(cè)定龍膽苦苷的含量， RSD為050％，表明方法的重現(xiàn)性較好。

27 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的撥云錠樣品約014 g，精密稱定，共6份，加入一定量的龍膽苦苷對(duì)照品溶液，揮干溶液，按“21”項(xiàng)下供試品溶液制備成加樣回收率供試液，并依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 龍膽苦苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

樣品理論量

/mg 加入量

/mg 實(shí)測(cè)量

/mg 回收率

/％ 平均回收率

/％ RSD

/％

09976 1068 2055 98979

09897 1068 2046 98934

09828 1068 2033 98363 9879 057

09843 1068 2030 97876

09824 1068 2043 99292

09815 1068 2042 99314

28 含量測(cè)定 取不同批次的撥云錠樣品，按供試品溶液的配制項(xiàng)下制備供試品溶液，每個(gè)批次的樣品平行制備3份，分別測(cè)定龍膽苦苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 撥云錠中龍膽苦苷的含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

批號(hào) 龍膽苦苷(mg/錠) RSD/%

20060601 1156 058

20061001 1033 064

20061002 1600 071

20061003 1694 039

20060602 1220 054

20060201 1284 026

29 檢測(cè)限 取配制好的對(duì)照品溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋成一系列濃度，依次測(cè)定，至主峰與基線噪音峰高比約為3∶1，記錄此時(shí)的色譜圖及濃度，結(jié)果龍膽苦苷的檢測(cè)限為538 ng。

3 討論

31 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 試驗(yàn)采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)龍膽苦苷的甲醇溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果于270 nm與253 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。由于253 nm波長(zhǎng)處的吸收度低于270 nm波長(zhǎng)處的吸收，從檢測(cè)靈敏度的角度考慮，選擇270 nm作為本次試驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

32 提取溶劑的選擇 龍膽苦苷為裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類成分［4］，易溶于甲醇、水，可溶于乙醇。考察了不同濃度的甲醇、乙醇和水為溶劑的提取結(jié)果，結(jié)果表明純甲醇的龍膽苦苷提取率最高。故選擇純甲醇作為提取溶劑。

33 提取方法的考察 龍膽苦苷為熱不穩(wěn)定性成分，研究表明超聲法和冷浸法所制備的供試品溶液中龍膽苦苷的含量明顯高于索氏提取法和熱回流法［5］。本次試驗(yàn)分別考察了以甲醇為溶劑的兩種提取方法，分別為冷浸法，超聲法。這兩種提取方法中龍膽苦苷的含量無(wú)顯著性差別。考慮到超聲法與冷浸法相比，超聲法更簡(jiǎn)單，易行，快捷，故采用超聲法，以甲醇為提取溶劑。此外，本次試驗(yàn)對(duì)超聲時(shí)間進(jìn)行了考察，依次測(cè)定了超聲提取5 min、10 min、15 min、30 min以及60 min龍膽苦苷含量測(cè)定的結(jié)果。結(jié)果表明采用純甲醇為溶劑，超聲提取15 min時(shí)，龍膽苦苷成分提取完全。

34 流動(dòng)相的選擇 本次試驗(yàn)參照文獻(xiàn)考察了以甲醇－水為流動(dòng)相的系統(tǒng)［6］與以乙腈－水為流動(dòng)相的系統(tǒng)［7］，結(jié)果表明，以甲醇－水（30∶70）為流動(dòng)相，可是龍膽苦苷的分離度，理論塔板數(shù)、峰的對(duì)稱性及出峰時(shí)間達(dá)到滿意的結(jié)果。

本次試驗(yàn)建立的高效液相色譜法測(cè)定撥云錠中龍膽苦苷的含量，該法靈敏、快速、準(zhǔn)確，可用于撥云錠的質(zhì)量控制。

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(收稿日期：2012-04-28）