扶正肺瘤方對黑色素瘤B16體內抑制作用的研究

歐陽郴生，趙 霞，古宏暉，楊麗娜，陳 鐘，汪桃利

(深圳市中醫院 腫瘤科，廣東 深圳 518033)

扶正肺瘤方是我科臨床長期運用的治療肺癌的中藥復方，具有一定的臨床療效，為進一步研究其確切作用，我們通過建立BALB/C無胸腺裸小鼠黑色素瘤B16模型,觀察扶正肺瘤方對腫瘤生長和轉移的作用，研究如下。

1 材料

1.1 動物 BALB/C無胸腺裸小鼠，體質量18～20 g，4～5周齡，清潔級，36只，雌雄各半，中國醫學科學院動物研究所提供，飼養環境為無特殊病原體條件(SPF)。

1.2 瘤株 黑色素瘤B16，購自中山醫科大學腫瘤研究所。

1.3 供試品 扶正肺瘤方，由本院制劑室提供，用生理鹽水配制成不同濃度藥液,2～8 ℃冷藏備用。

1.4 試劑 福爾馬林液、雙抗(鏈霉素100 μg/mL，青霉素100 U/mL)，胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶，D-Hanks液、谷氨酰胺，RPMI1640培養基。

1.5 實驗器材 游標卡尺，哈爾濱北量螺紋量規工具制造廠；電子天平，BS22型，德國賽多利斯；倒置顯微鏡，CKX31型，Olympus公司；CO2培養箱，2406-2型,美國Sheldon公司。

2 方法

2.1 黑色素瘤B16細胞培養 參照文獻[1]方法，B16黑色素瘤瘤株在10%胎牛血清RPMI1640培養基(含雙抗)，37 ℃，5%CO2環境中進行傳代培養。取對數生長期的腫瘤細胞，吸去培養液，收集細胞，D-Hank液洗滌2次，臺盼藍染色，顯微鏡下計數存活腫瘤細胞，存活腫瘤細胞應大于95%。調整細胞濃度為2×107/mL。

2.2 建立黑色素瘤B16動物模型 消毒BALB/C裸小鼠右側腋窩皮膚，注射黑色瘤B16細胞懸液，0.2 mL/只。

2.3 分組與給藥 采用隨機分組方法，將36只裸小鼠分為3組,每組12只。分別為扶正肺瘤方低劑量(18g/kg體質量)、高劑量(36g/kg體質量)組和模型對照組。于移植腫瘤當日始，低劑量組和高劑量組分別給予相應劑量扶正肺瘤方藥液，模型對照組給予等體積生理鹽水。給藥途徑為經胃腸給藥，每日1次，每次0.5 mL，連續給藥21 d。

2.4 采集標本 第21天處死動物，剝離腋下腫瘤組織，采集脾臟和肺臟，分別稱重。

2.5 觀察指標與方法[2]

2.5.1 一般情況觀察 每天記錄飼料及飲用水的消耗量并觀察裸小鼠的精神和活動情況。

2.5.2 腫瘤轉移情況 用福爾馬林固定肺臟，解剖鏡下觀察并計數兩肺的腫瘤轉移灶(結節)，病理組織學檢查證實結節由黑色素瘤細胞構成。

2.5.3 脾指數 脾指數=脾重(mg)/體質量(10 g)。

2.5.4 抑瘤率 抑瘤率%=(1-T/C)×100%，T/C為實驗組/對照組平均瘤重。

2.5.5 腫瘤平均直徑倍增時間(MDDT) 從接種腫瘤后第6天起，用游標卡尺測量腫瘤的3個相互垂直的直徑，取平均值，即為平均直徑(MD)。隔日測量1次，觀察MD達到起始值2倍的時間，即腫瘤平均直徑倍增時間(MDDT)。

2.5.6 肺轉移抑制率 肺轉移抑制率=[(對照組肺轉移瘤灶數-實驗組肺轉移瘤灶數)/對照組肺轉移瘤灶數]×100%。并觀察雙側腋窩淋巴節轉移情況。

3 結果

3.1 一般情況 接種黑色素瘤B16細胞后,動物精神、活動無明顯異常。給予扶正肺瘤方藥液后，動物外觀、精神、活動、飲食情況均無明顯異常變化。給藥2周后,對照組動物普遍出現活動減少、精神萎靡，皮膚無光澤。扶正肺瘤方高、低劑量組小鼠于整個實驗期間外觀無明顯異常變化,精神、活動、飲食均正常。給藥第17天對照組1只裸鼠因操作失誤導致灌胃時死亡，其它實驗動物無中途死亡。

3.2 脾指數 見表1。

表1 B16黑色素瘤脾重、脾指數比較(±s)

3.3 腫瘤平均直徑倍增時間和抑瘤率 見表2。

表2 B16黑色素瘤腫瘤平均直徑倍增時間和抑瘤率(±s)

3.4 體質量和肺重 見表3。

表3 B16黑色素瘤小鼠體質量、肺重比較(±s)

3.5 肺轉移抑制率、肺內轉移率和結節數 對照組肺部轉移率為100%，高劑量組的肺內轉移率僅為66.67%，低劑量組的肺內轉移率也僅為75.00%，見表4。

表4 B16黑色素瘤小鼠肺內轉移率及肺內結節數

3.6 各組淋巴結轉移(平均重量)比較 見表5。

表5 B16黑色素瘤小鼠淋巴結轉移情況(±s) mg

4 討論

通過建立BALB/C無胸腺裸小鼠黑色素瘤B16動物模型,經過21 d的灌胃給藥，給藥組均呈現不同程度MDDT延長，腫瘤重量、肺重量減輕，肺轉移結節數和淋巴結轉移數及淋巴結重量減少，肺轉移率減少，脾指數增加，抑瘤率達43.94%。由此可見,扶正肺瘤方可有效提高裸小鼠免疫功能，抑制腫瘤生長和轉移。

原發性支氣管肺癌是最常見的肺原發性惡性腫瘤，也是臨床最常見的惡性腫瘤之一。近20年來,其發病率和病死率在全部惡性腫瘤中上升幅度最大，已居首位[3]。肺癌可分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC占肺癌總數的80%以上。SCLC以全身化療為主,聯合放療和手術為主要治療手段；NSCLC則以外科手術結合術后放、化療為主。化療、放療對縮小瘤體有較肯定的療效，但其對骨髓、肝腎及免疫等功能的損傷較大，對人體造成明顯的毒副作用，降低患者生存質量。中醫藥療法是我國肺癌治療的特色，應用中藥配合放化療較單純放化療治療肺癌具有明顯優勢[4-7]。

扶正肺瘤方是我科在中醫理論的指導下，總結多年臨床研究經驗，并經前期反復實踐摸索，長期運用于臨床治療肺癌的中藥復方。臨床表明，應用扶正肺瘤方聯合化療可以改善肺癌患者臨床癥狀，減輕化療的毒副反應，提高生活質量，延長生存期。為了進一步研究扶正肺瘤方對肺癌的治療效果，探究藥物作用機制,我們通過建立裸小鼠黑色素瘤B16模型來觀察研究扶正肺瘤方對腫瘤的作用。

裸小鼠黑色素瘤B16模型是比較成熟的腫瘤實驗模型[8]，在本實驗中，造模全部成功，同側、對側腋窩淋巴結均出現轉移灶，且對照組肺部轉移率為100%。

本實驗發現，扶正肺瘤方能抑制黑色素瘤B16在BALB/C裸小鼠腋下種植局部的生長,給藥組腫瘤MDDT及瘤重均較對照組減小，高劑量組抑瘤率達到43.94%。MDDT為腫瘤平均直徑(MD)達到起始值2倍的時間，反映腫瘤的增殖速度，倍增時間越長，說明腫瘤的生長越緩慢。說明了扶正肺瘤方能有效抑制腫瘤生長。給藥組脾指數增加，肺內轉移率減少，肺轉移結節減少，同側及對側腋窩淋巴結重量較對照組減輕，說明扶正肺瘤方能提高免疫功能，對腫瘤轉移起抑制作用。

本實驗證明扶正肺瘤方對黑色素瘤B16模型有一定的抑瘤、抗轉移作用,本次實驗的研究內容對進一步探索扶正肺瘤方抑制腫瘤的作用機制具有積極的意義。

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