人端粒酶逆轉錄酶基因轉染人髓核細胞的安全性研究

吳劍宏，阮狄克，王德利，張 超，何 勍，王超鋒，張 燕，辛洪奎，顧 韜，徐 成，劉 玥

近年來，基因治療成為椎間盤退變性疾病生物學治療的研究熱點。隨著對端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)基因研究的深入，通過載體將TERT基因轉入細胞，進而激活細胞端粒酶活性，使細胞延長壽命，甚至使細胞“永生化”成為可能［1-2］。腺相關病毒是目前在基因治療研究領域常使用的一種病毒類載體［3］，本研究使用腺相關病毒為載體介導人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因轉染人椎間盤髓核細胞，評估重組腺相關病毒人端粒酶逆轉錄酶基因(recombinant adeno-associated virus vector-mediated hTERT gene，rAAV-hTERT)是否能轉染體外培養人髓核細胞，并對其安全性相關指標進行檢測，為進一步的功能研究及在體研究提供安全性證據。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

DMEM培養液、PBS液(Hyclone)、胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)(Gibco)，0.25%Trypsin-EDTA(Gibco)，trizol液(Invitrogen)，Ⅱ型膠原酶(碧云天)，鼠抗人hTERT蛋白單抗及羊抗兔/鼠二抗(Abcam)。PCR、RT-PCR 試劑盒(Promega)，75 μm的細胞濾膜(Millipore)，6孔培養板(corning)，PCR引物根據PCR引物設計原則，按照hTERT及甘油醛-3-磷酸 脫 氫 酶 (glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)基因序列，利用 Prime Premer 5軟件設計，由北京博邁德生物公司合成。3～4周齡裸鼠由北京大學醫學部動物中心提供。rAAV-hTERT(病毒滴度=1×1012μg/mL)由北京五加和生物技術公司包裝。Hela細胞由解放軍307醫院婦產科實驗室惠贈。

1.2 方法

1.2.1 人椎間盤髓核細胞的分離與培養

椎間盤髓核標本來源于1名19歲男性的正常椎間盤髓核組織，將標本用PBS清洗2次后仔細分離出髓核組織，將髓核組織修剪成1 mm3大小的組織塊，0.025% Ⅱ型膠原酶置于 37°C、5%CO2的細胞培養箱中消化14～16 h，將消化液用75 μm的細胞濾膜過濾，收集細胞以1×105/孔的密度培養于6孔培養板，以含10%FBS的DMEM為培養液，置于37°C含5%CO2的細胞培養箱中，2～3 d換液1次，于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態。

1.2.2 rAAV-hTERT轉染體外培養人髓核細胞

轉染培養傳代后的第2代人髓核細胞(70%～80%融合時)，計數細胞，用PBS清洗細胞2次，按推薦的感染復數(multiplicity of infection，MOI)每細胞105v.g 加入病毒轉染液 2 mL，置于 37°C、5%CO2細胞培養箱中培養2 h，棄去病毒轉染液，無血清DMEM培養基清洗2次，加入含10%FBS的DMEM培養基，培養傳代，于不同的時間點取出部分細胞進行檢測。實驗共分3組:①rAAV-hTERT轉染組;②AAV空病毒轉染組;③未轉染組。

1.2.3 rAAV-hTERT轉染后轉錄水平的檢測(RTPCR)

用半定量的反轉錄聚合酶鏈反應的方法來檢測hTERT基因及GAPDH基因(內參照)在mRNA水平上的表達情況，在轉染后的7 d、90 d、120 d、150 d各取6孔rAAV-hTERT轉染組、AAV空病毒轉染組及未轉染組髓核細胞，將各組細胞各自混勻后用trizol法提取各組 RNA，然后利用 AMV random dT primer和AMV在42°C條件下孵育1 h，將 RNA反轉錄成 cDNA，以cDNA為模板在 PCR儀上進行PCR反應，PCR反應條件如下:95°C、5 min，94℃、45 s，56℃、45 s，72℃、45 s，33 個循環;72℃10 min。GAPDH上游引物:5’-GAA GGT CGG AGT CAA CGG-3’;GAPDH下游引物:5’-GGA AGA TGG TGA TGG GAT T-3’;hTERT基因上游引物:5’-GCC AGC ATC ATC AAA CCC-3’;hTERT基因下游引物:5’-CCA CGA ACT GTC GCA TGT AC-3’，PCR 產物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 rAAV-HTERT轉染后蛋白水平表達的檢測(western-blot)

在轉染后的 7 d、90 d、120 d、150 d 各取 6 孔rAAV-hTERT轉染組、AAV空病毒轉染組及未轉染組髓核細胞，以冷PBS洗滌3次后加入預冷的細胞裂 解 液 (1% NP-40，20 mmol/L Tris pH 7.4，150 mmol/L NaCl，10% 甘油，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，10 mL抑菌肽，1 g/mL亮肽素，500 mmol/L正礬酸鈉)，混勻，置于冰上 30 min，4℃、12000 ×g離心20 min，收集上清，BioRad法蛋白定量后調整蛋白濃度一致。加等量的2×SDS上樣緩沖液，94℃變性10 min，配制150 L的聚丙烯酰胺分離膠，每孔上樣60 g蛋白，電泳分離蛋白后，轉移至硝酸纖維素膜，5%的脫脂牛奶封閉1 h后各樣品用8%SDS-PAGE電泳分離，之后轉移到硝酸纖維素膜。轉移好的硝酸纖維素膜用5%脫脂奶粉+TBS 37℃封閉1 h，鼠抗人hTERT蛋白單抗(1∶1000，Abcam)4℃ 孵育過夜，TBS/0.1%Tween-20洗滌3次后加人辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠(1∶2000，Abcam)，37℃ 孵育1 h，TBS/0.1%Tween-20洗膜后用增強化學發光法檢測目的條帶的表達。圖像掃描進行Western blot免疫印跡分析。另配置120 g/L的分離膠，按傳統方法做內參GAPDH的Western blot免疫印跡。

1.2.5 髓核細胞染色體核型分析

取rAAV-hTERT轉染組培養10代(120 d)細胞和未轉染組2代髓核細胞培養于60 mL培養瓶中，以含10%FBS的DMEM為培養液，置于37°C、5%CO2細胞培養箱中，隔日換液，待細胞長滿培養瓶底90% ～100%時，加入秋水仙素，終濃度為0.4 mg/mL，繼續培養2 h后常規收獲、制片，G顯帶后進行核型分析并顯微照相。

1.2.6 髓核細胞裸鼠致瘤性分析

取3組體外傳代7 d的髓核細胞及Hela細胞消化、離心，將細胞濃度調為3×107/mL，各取100 μL細胞懸腋注入5周齡裸鼠腋下，接種完畢后，置恒溫、恒濕的無菌凈化屏障系統飼養，接種后3個月處死裸鼠，記錄腫瘤生長情況。

1.3 統計學處理

所有測量數據均用SPSS 13.0統計軟件分析，對灰度值變化比較采用單因素方差分析，對染色體異常比率行卡方檢驗，以P＜0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞形態學觀察

各組細胞在單層培養條件下共培養14代(＞150 d)，倒置顯微鏡觀察顯示病毒轉染后細胞形態較未轉染細胞無明顯差異，各組細胞在5代以前形態以多角形及長梭形為主，隨著傳代次數的增加，長梭形細胞比例逐漸增加，至培養14代(150 d)時，細胞形態呈現為一致的長梭形。

2.2 hTERT基因mRNA及蛋白表達檢測結果

RT-PCR(見圖1a)及Western-blot(見圖1b)檢測結果顯示了一致性:3組細胞均檢測到內參條帶(GAPDH，220bp)，rAAV-hTERT轉染組在轉染后的7 d，90 d，120 d均可檢測到hTERT基因的表達，在轉染后150d未能檢測到hTERT基因表達;另外2組則始終未檢測到hTERT基因的表達。通過對PCR及Western-blot條帶灰度值的比較分析(見圖1c)，轉染后第7天hTERT基因mRNA表達的相對水平是最高的，而隨著細胞傳代次數及時間的增加，hTERT基因mRNA表達的相對水平逐漸降低。

圖1 hTERT基因的表達Fig.1 The levels of mRNA and protein expression for hTERT

2.3 髓核細胞染色體核型分析結果

體外培養2代(14 d)未轉染組中期髓核細胞分裂數為50個，10代(120 d)轉染rAAV-hTERT組中期髓核細胞分裂數為75個(見表1)，結果顯示細胞為男性染色體核型，染色體總數為46條，可見部分染色體丟失(亞二倍體)，G-帶核型分析未見染色體結構異常克隆，基本核型為男性正常核型(46，XY;見圖2)。

2.4 裸鼠致瘤性結果

細胞接種1周左右形成肉眼可見腫瘤，3個月后3組細胞均未觀察到裸鼠腋下腫瘤生長，而Hela細胞接種組可見明顯的腫瘤形成，大小約3 cm×2 cm×2 cm(見圖3)。

表1 髓核細胞染色體核型分析結果Tab.1 The results of the karyotypic analysis

圖2 髓核細胞染色體核型分析代表圖Fig.2 Karyotype analysis of rAAV-hTERT transfected HNP cells

圖3 裸鼠致瘤性結果圖Fig.3 The results of the oncogenicity in nude mice

3 討 論

椎間盤的退變是受年齡、機械物理、細胞、基因以及生化因子等多種因素影響的復雜的病理生理改變［4-5］。目前的各種手術及非手術治療手段僅僅是針對椎間盤退變引起的各種臨床癥狀的治療，而不是從恢復椎間盤細胞功能的角度上去逆轉椎間盤的退變。生物學治療由于具有延緩甚至逆轉椎間盤退變的潛能，而成為近年來的研究熱點［6］。在生物學治療策略中，種子細胞的選擇是一個非常關鍵的問題。近年來，在椎間盤退變性疾病種子細胞選擇的研究上有很多進展［7-8］，可供選擇的種子細胞也很多，如脂肪干細胞、骨髓間充質干細胞及軟骨細胞等，雖然均能達到生物學治療的部分目的，但也存在著一些缺點和不足:①干細胞誘導分化的條件難以穩定掌握;②誘導分化的類髓核細胞的功能穩定性難以長期維持;③軟骨細胞分泌的細胞外基質成分與髓核組織在量上有著明顯的區別［9］。因而，盡管這些細胞都能在某種程度上部分恢復髓核的細胞外基質含量，但其畢竟不是真正意義上的髓核細胞。

因而，研究者又回過頭來繼續對髓核組織來源細胞加以研究，期望通過挖掘髓核細胞本身的未知潛能，使其作為生物學治療的種子細胞來源。理論上，自體組織來源的細胞是最佳的種子細胞，然而髓核細胞來源有限，在長期的體外培養過程中容易發生細胞的去分化現象。隨著對人類端粒酶基因的研究深入，通過將hTERT基因功能片段轉入成體細胞，從而激活細胞端粒酶活性，進而維持端粒長度以幫助細胞逃過衰老過程，成為延長細胞壽命的一種良好方法。迄今為止，學者們已經利用hTERT基因在19種不同組織的35種細胞上進行了驗證，證實hTERT基因能夠延長細胞的生命，維持細胞的功能［10］。這一轉基因策略同樣也為延長體外培養髓核細胞壽命提供了可能。一個高效的基因治療載體是基因治療成功的關鍵，AAV是目前在基因治療領域應用非常廣泛的一個病毒類載體，AAV擁有較多的優勢:①低致病性，低免疫原性，安全性好，迄今為止尚未在人類和哺乳動物身上發現和AAV相關的疾?。?1-12］;②表達時間長;③轉染效率較高，能轉染分裂期和非分裂期細胞［13-14］。

對于椎間盤退變這種慢性疾病來說，需要轉基因能在髓核細胞內獲得一個長期、安全、高效的表達，這也是選擇AAV作為基因治療載體的主要原因。然而，在驗證rAAV-hTERT基因轉染髓核細胞是否有應用價值之前，尚需進行2步關鍵性的基礎工作:①必須在體外實驗中證實髓核組織對目的基因轉染是易感的;②hTERT基因轉染髓核細胞是安全的。本實驗通過AAV載體將hTERT基因導入體外培養人椎間盤髓核細胞，并證實導入的hTERT基因能在髓核細胞內正確的表達，持續表達時間 ＞120 d。

正常人的體細胞染色體數目為46條，并有一定的形態和結構。染色體在形態結構或數量上的異常被稱為染色體異常。染色體核型分析是細胞遺傳學研究的基本方法，是研究物種演化、分類以及染色體結構、形態與功能之間的關系所不可缺少的重要手段。經核型分析后，可根據染色體結構和數目的變異來判斷生物的病因，比如是由于缺少了什么樣的基因才導致的這種疾?。?5］。本實驗結果顯示rAAV-hTERT轉染后10代髓核細胞與未轉染2代髓核細胞均有一定比例的染色體結構異常，但2組細胞異常率差異并無統計學意義(P＜0.05)，未出現多倍體及染色體異常結構的克隆;由于并非固定部位的克隆，所以染色體數目的減少更可能是實驗操作的原因，而非異常結構克隆，顯示在遺傳水平細胞未發生突變，不具致瘤性。

裸鼠體內致瘤性也是檢驗細胞致瘤性的一項標準技術［16］，裸鼠為人工去胸腺培育動物，其自身排斥反應較小，目前已廣泛應用于腫瘤學研究中。本研究所選用的Hela細胞為宮頸癌細胞［17-19］，較之于其他來源腫瘤細胞，其特點為增殖異常迅速，從1951年發現至今，已培養了50多年，號稱“不死”細胞，目前已廣泛應用于腫瘤學相關疾病的研究中。本研究選擇Hela細胞為陽性對照組，對其進行裸鼠體內移植研究，結果發現，Hela細胞在實驗裸鼠中種植后1周左右形成肉眼可見腫瘤，而另外3組細胞在移植3個月后均未觀察到裸鼠腋下腫瘤生長，提示rAAV-hTERT轉染髓核細胞在有限的體外培養時間內不具有致瘤性，但其更長期的致瘤性還有待于進一步的觀察研究。

本實驗研究結果顯示通過體外構建的rAAV-hTERT能成功轉染體外培養人髓核細胞并正確表達，通過對體外培養細胞的染色體核型分析及裸鼠成瘤實驗顯示，rAAV-hTERT轉染髓核細胞體外長期培養后未出現基因水平的突變，不具有裸鼠致瘤性，證實在體外培養一定時間內rAAV-hTERT轉染髓核細胞是安全的，為進一步的rAAV-hTERT轉染髓核細胞的功能研究及體內實驗提供了安全性證據。

［1］ Chang MW，Grillari J，Mayrhofer C，et al.Comparison of early passage，senescent and hTERT immortalized endothelial cells［J］.Exp Cell Res，2005，309(1):121-136.

［2］ Robertson DM，Li L，Fisher S，et al.Characterization of growth and differentiation in a telomerase immortalized human corneal epithelial cell line［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46(2):470-478.

［3］ Daya S，Berns KI.Gene therapy using adeno-associated virus vectors［J］.Clin Microbiol Rev，2008，21(4):583-593.

［4］ Cheung KM，Karppinen J，Chan D，et al.Prevalence and pattern of lumbar magnetic resonance imaging changes in a population study of one thousand forty-three individuals［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2009，34(9):934-940.

［5］ 陳國仙，葉道明，王萬明，等.椎間盤退變機制研究進展［J］.脊柱外科雜志，2006，4(3):174-178.

［6］ 任大江，李放，孫天勝，等.腰椎間盤退變性下腰痛的病理生理學及治療對策的研究進展［J］.脊柱外科雜志，2008，6(4):246-248.

［7］ Allon AA，Aurouer N，Yoo BB，et al.Structured coculture of stem cells and disc cells prevent disc degeneration in a rat model［J］.Spine J，2010，10(12):1089-1097.

［8］ Yang X，Li X.Nucleus pulposus tissue engineering:a brief review［J］.Eur Spine J，2009，18(11):1564-1572.

［9］ Minogue BM，Richardson SM，Zeef LA，et al.Characterization of the human nucleus pulposus cell phenotype and evaluation of novel marker gene expression to define adult stem cell differentiation［J］.Arthritis Rheum，2010，62(12):3695-3705.

［10］ Harley CB.Telomerase therapeutics for degenerative diseases［J］.Curr Mol Med，2005，5(2):205-211.

［11］ Wu Z，Asokan A，Grieger JC，et al.Single amino acid changes can influence titer，heparin binding，and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes ［J］.J Virol，2006，80(22):11393-11397.

［12］ Wu Z，Asokan A，Samulski RJ.Adeno-associated virus serotypes:vector toolkit for human gene therapy［J］.Mol Ther，2006，14(3):316-327.

［13］ Grieger JC，Samulski RJ.Adeno-associated virus as a gene therapy vector:vector development，production and clinical applications［J］.Adv Biochem Eng Biotechnol，2005，99:119-145.

［14］ Dinculescu A，Glushakova L，Min SH，et al.Adeno-associated virus-vectored gene therapy for retinal disease［J］.Hum Gene Ther，2005，16(6):649-663.

［15］ Mao XG，Wang JH，Su WT，et al.Karyotypic evolution in family Hipposideridae(Chiroptera，Mammalia)revealed by comparative chromosome painting， G-and C-banding ［J］.Dongwuxue Yanjiu，2010，31(5):453-460.

［16］ Funakoshi-Tago M，Tago K，Sumi K，et al.The acute lymphoblastic leukemia-associated JAK2 L611S mutant induces tumorigenesis in nude mice［J］.J Biol Chem，2009，284(19):12680-12690.

［17］ 程麗，劉梅梅，隋麗華，等.YH-16對宮頸癌Hela細胞及其裸鼠皮下移植瘤作用研究［J］.現代腫瘤醫學，2008，16(1):7-10.

［18］ 石英愛，趙強，張海英，等.沉默HeLa細胞端粒酶活性對其在裸鼠體內移植瘤生長的影響［J］.中國實驗診斷學，2009，13(9):1152-1154.

［20］ Rebecca Skloot.The immortal life of Henrietta Lacks［M］.New York:Crown Publishing Group，2010.