表沒食子兒茶素沒食子酸醋對人胃癌細胞遷移、侵襲和cripto蛋白表達的影響

(江蘇大學附屬人民醫院，江蘇鎮江 212002)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率較高，主要原因是發現時即已有癌細胞侵襲和轉移。茶多酚是茶葉中三十多種多酚類物質的總稱，是一種從綠茶中提取的純天然混合物，主要由四大類物質組成，其中以兒茶素最為重要，占多酚類總量的60% ～80%，兒茶素類主要由表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯等幾種單體組成，其中以EGCG的含量最豐富。研究發現，EGCG在體內外對許多腫瘤細胞增殖具有抑制作用［1～5］，但是對胃癌細胞侵襲研究甚少，抗癌機制亦不完全清楚。2012年1～3月，我們觀察了EGCG對人胃癌細胞遷移、侵襲的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 EGCG(Sigma公司)，用二甲基亞砜(DMSO)配成儲液，－20℃冰箱保存;實驗時用RPMI1640培養基稀釋，DMSO的最終濃度＜0.9%;人胃癌BGC823細胞株，本院組織細胞生物庫凍存，購自中科院上海細胞所細胞庫;Trizol試劑購自Invitrogen公司;BCA蛋白分析試劑盒購自Pierce公司;基底膜膠購自BD公司。RPMI1640、新生小牛血清均購自Gibco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及處理 人胃癌BGC823細胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640液中，37℃、CO2培養箱中培養。每日觀察，待細胞至對數生長期，實驗組加入20、40、80 μmol/L 的 EGCG 處理，對照組以RPMI1640代替EGCG處理細胞，備測。

1.2.2 細胞遷移能力檢測 采用劃痕法。先用marker筆在6孔板背后，均勻劃橫線，每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。取對數生長期細胞消化、計數，使用培養基配制成濃度為8×105個/mL的細胞懸液，6孔細胞培養板中每孔加入1 mL細胞懸液，放入37℃，5%CO2培養箱中培養直至細胞鋪滿單層。用100 μL槍頭沿培養板底部呈“一”字形劃痕;用槍頭盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。棄去培養基，用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，用培養基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入1 000 μL相應的含藥培養基，同時設立陰性對照組;6孔細胞培養板置于37℃，5%CO2培養箱中培養24 h，拍照。記錄細胞遷移距離。

1.2.3 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell法。上下室之間鋪聚碳酸醋微孔濾膜(孔徑8 μm)，濾膜上包被有Matrigel。制備ECM gel小室:將ECM gel置于4℃預冷2 h，Transwell小室上室加入ECM gel 50 μl，置于37 ℃，5%CO2培養箱內直至 ECM gel凝固為止。制備細胞懸液:撤去血清饑餓細胞24 h，消化細胞，計數，用含0.1%FBS的培養基重懸細胞，調整細胞濃度為1×106個/mL。下室加入500 μL含20%FBS和相應濃度Endostar的培養基，上室加入100 μL密度為1×106個/mL的細胞懸液，ECM gel小室置于37℃，5%CO2培養箱內培養36 h。擦去小室上表面細胞，24孔板中每孔加入0.5 mg/mL的MTT 500 μL，將小室置于其中，使膜浸沒在培養基中，37℃ 4 h后取出，每孔加入 DMSO 500 μL，將小室置于其中，使膜浸沒在DMSO中，振蕩10 min，使甲臜充分溶解。取出小室，將DMSO移到96孔板中，每孔100 μL，于酶標儀上490 nm處讀取OD值，按照以下公式計算侵襲率。侵襲率=(測定組OD值－空白對照組OD值)/(遷移組OD值－空白對照組OD值)×100%。

1.2.4 cripto基因蛋白檢測 采用免疫熒光法。將胃癌細胞接種到預先放置蓋玻片的培養皿中，細胞和蓋玻片表面完全吸附后，用PBS洗2次，丙酮固定。PBS振洗后吹干。滴加 cripto單克隆抗體(1∶2 000)覆蓋整個切片，4℃過夜。PBS振洗3次后吹干。滴加1∶50稀釋的FITC標記的二抗，37℃保溫30 min。PBS振洗2次后用蒸餾水振洗。50%緩沖甘油封片。在熒光顯微鏡下觀察，拍照，熒光強度掃描。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件包進行統計學處理，計量數據以±s表示。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 細胞遷移能力 對照組及實驗組不同濃度(20、40、80 μmol/L)細胞遷移距離分別為(420 ±15)、(278±12)、(189±11)、(112±8)μm，細胞遷移距離呈濃度依賴性減少(P均＜0.001)。

2.2 細胞侵襲能力 對照組及實驗組不同濃度(20、40、80 μmol/L) 細胞穿過濾膜的細胞分別為(38.6 ±1.5)、(28.2 ±1.8)、(15.8 ±1.2)、(7.8 ±1.6)個，穿膜細胞數呈濃度依賴性減少(P均 ＜0.001)。

2.3 cripto蛋白表達 對照組及實驗組不同濃度(20、40、80 μmol/L)細胞 cripto 蛋白表達量分別為(51.86 ±3.36) ×102、(28.56 ±2.25) ×102、(15.36±3.22) ×102、(8.39 ±2.58) ×102pg，cripto 蛋白表達呈濃度依賴性減少(P均＜0.05)。

3 討論

已證實，EGCG對許多腫瘤細胞生長具有一定的抑制作用［1～6］。研究發現，EGCG 可明顯抑制胃癌細胞生長增殖，其機制主要與誘導細胞凋亡有關［7，8］。但目前EGCG對胃癌細胞遷移侵襲的研究甚少。

遷移性是轉移性癌細胞的重要特征之一，在成體組織中大多數正常細胞不具有遷移性，活躍遷移的正常細胞主要是中性粒細胞、巨噬細胞和小腸黏膜上皮細胞等。而惡性腫瘤細胞一般具有十分活躍的遷移性。體外培養時，正常細胞具有遷移的接觸抑制，因而呈單層生長;而癌細胞喪失了遷移的接觸抑制，從而呈多層重疊生長。本研究發現，胃癌BGC823細胞具有較強的遷移性，而經EGCG處理后，細胞遷移能力明顯減弱，且呈劑量依賴性，提示EGCG可以有效地抑制胃癌細胞遷移。

腫瘤細胞侵襲轉移是一個復雜的過程。一旦腫瘤細胞從原發腫瘤上脫落，將侵入宿主的細胞外基質，然后穿透淋巴管和血管，進行遠處轉移。在此過程中，腫瘤細胞侵襲細胞外基質是重要的步驟。本研究所用Transwell方法檢測癌細胞侵襲中所用的基質膠含有Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、巢蛋白、硫酸肝素蛋白多糖等成分，與細胞外基質成分非常相近。因此，能有效地在體外模擬腫瘤細胞的侵襲過程。本研究實驗組細胞侵襲呈濃度依賴性減少，提示EGCG可明顯抑制胃癌細胞的侵襲能力，從而抑制癌細胞的轉移。

cripto基因是表皮生長因子重要成員之一，定位在人類染色體 3p21.3［9］，編碼 cripto 蛋白，又稱cripto基因。研究發現，cripto基因在許多實體瘤中過度表達，而正常組織表達極低或不表達［10～14］。前期采用免疫組化方法檢測大腸癌相關組織，發現cripto基因蛋白過表達與大腸癌細胞漿膜侵襲、淋巴結轉移和Duke分期密切相關，而與大腸癌分化程度無關［13］。提示cripto基因與大腸癌細胞侵襲轉移密切相關。本文結果發現，實驗組癌細胞cripto蛋白表達呈濃度依賴性減少，提示cripto基因參與調控EGCG抑制胃癌細胞侵襲能力。

總之，EGCG可明顯抑制胃癌細胞體外惡性遷移和侵襲能力，其機制可能與下調cripto基因表達有關。

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