新型優質發酵及酶解餅粕蛋白飼料資源開發利用現狀與展望

李愛科 贠婷婷 張曉琳 綦文濤 韓 飛 韓 偉 付亭亭

(國家糧食局科學研究院，北京 100037)

近年來，一方面，我國畜牧業的高速發展，使得我 國蛋白飼料資源短缺的問題日益突出；另一方面，生物技術的獨特優勢，使其應用領域不斷擴大，以微生物發酵和酶解為主要方法的蛋白飼料資源高效轉化利用技術越來越受到人們的重視。我國飼料工業“十二五”發展規劃中明確要求“建設利用動物加工副產品深加工生產優質蛋白的示范基地，利用食品工業糟渣、廢液經微生物發酵生產優質蛋白的示范基地”。飼料微生物發酵與酶解技術是指在人為可控制的條件下，以動、植物性副產品為主要原料，通過高效生物因子（多種微生物活菌、各種分解酶）的作用，降解部分多糖、蛋白質和脂肪等大分子物質，生成有機酸、可溶性肽等小分子物質，形成營養豐富、適口性好、活菌含量高的生物飼料或飼料原料。發酵和酶解植物蛋白飼料較之常規蛋白飼料除含有更多小肽等易消化吸收物質外，還含有豐富的酶類、益生菌等生物活性物質，這些物質的存在大大提高了植物蛋白的營養價值，還可以改善動物腸道菌群結構，提高動物本身的免疫力。同時，原料中的抗營養因子，尤其是熱不敏感類抗營養因子也得到顯著地降解，減少了對動物的毒害作用，提高了原料的消化率和飼用價值。但是發酵酶解植物蛋白飼料領域也同樣存在許多問題亟待解決，如優良發酵菌種的篩選；最佳發酵及酶解條件和工藝的確定；產品質量標準和穩定性的深入研究；公正、合理的產品質量評價體系等等。因此，本文簡單介紹了微生物發酵與酶解技術在蛋白飼料資源開發領域應用的特點和研究現狀，并對其存在的問題和未來的發展方向提出了建議。

1 微生物發酵植物蛋白飼料

1.1 微生物發酵餅粕蛋白飼料的方法與特點

微生物發酵蛋白飼料的方法包括固態發酵、液態發酵、吸附在固體表面的膜狀培養以及其他形式的固定化細胞培養等，目前多以固態發酵為主。固態發酵是指微生物在沒有或幾乎沒有自由水的固體營養基質上生長的過程，且有厭氧和好氧之分。固態發酵歷史悠久，并具有培養基簡單且來源廣泛、投資少、能耗低、技術較簡單、產物的產率較高、環境污染較少、后處理加工方便等優點，所以應用較多。

1.2 微生物發酵餅粕蛋白飼料的優勢

1.2.1 顯著去除飼料原料中的內源毒素及抗營養因子

油脂餅粕中的部分內源毒素及抗營養因子在不同制油工藝中，尤其在傳統高溫、高壓壓榨浸提工藝中難以去除，通過微生物發酵是有效解決這一難題的主要措施。

1.2.1.1 發酵棉粕

人們在20世紀50年代時發現，成年反芻動物具有避免游離棉酚(FG)中毒的生理現象,1960年Roberts等根據這一生理現象利用牛、羊的瘤胃微生物對棉籽餅粕進行發酵脫毒,取得成功并申請了美國專利。W.Baugher等(1969)在利用抗生素滅菌條件下，利用1株Diplodia真菌對游離棉酚(FG)成功進行“生料”發酵脫毒，脫毒率大于90%，殘留FG比未脫毒棉粕中FG對動物的毒性少，此方法在仔豬、雞日糧中取得成功應用。而微生物固態發酵法在我國是20世紀80年代后期逐漸發展起來的一種新的棉籽餅粕脫毒方法。鐘英長等(1989)采用添加棉酚的培養基進行脫毒微生物的自然篩選和誘變育種，獲得5株對棉酚有高脫毒率而不產黃曲霉毒素的霉菌，對未經榨油的棉籽仁粉的脫毒率可達60%～74%。施安輝等(1998)、楊繼良等(2000)獲得了脫游離棉酚能力較強的酵母菌。張慶華等(2007)采用熱帶假絲酵母、擬內胞霉和植物乳桿菌協同固態發酵,對棉粕脫毒率達85.30%；吳偉偉（2009）研究了黑曲霉與釀酒酵母混合固態發酵棉籽餅粕中游離棉酚脫毒率為95.51%。傳統發酵法一般采用高溫、高壓滅菌，實際主要是脫除FG的因素(賈曉鋒等，2009)，脫毒率可以達到95%以上，但也影響到氨基酸的消化利用；另外，不同微生物對FG脫除影響很大，部分菌種還使FG顯著增高。賈曉鋒(2008)采用黑曲霉和熱帶假絲酵母發酵棉籽粕，認為假絲酵母對棉籽粕中游離棉酚有一定的脫毒作用，而黑曲霉增加了游離棉酚的含量，二者對棉酚均無明顯降解作用。而徐晶等(2012)通過對12株菌分別進行生料固態發酵得出，芽孢桿菌B12和假絲酵母 Cu1組合后脫毒率可達50.03%；芽孢桿菌B12和酵母8605組合脫毒率達到52.19%。我國的學者在利用微生物固態發酵生產脫毒棉籽餅粕的研究方面做了大量的工作，主要表現在3方面：①脫毒菌種的篩選；②發酵底物組成及發酵參數優化；③發酵前后棉籽餅粕營養成分及養分利用率比較研究。

1.2.1.2 發酵菜粕

國內外關于菜籽粕發酵的研究已有諸多報道。Rozan等(1996)使用少孢根霉發酵菜籽粕40 h后，總硫甙降解率為47%。蔣玉琴等(1999)利用乳酸菌、酵母菌、少孢根霉菌復合菌系發酵菜籽粕32 h，硫甙降解率達71.6%。Chiou等(2000)研究表明，米曲霉菌能大幅度地改善菜籽粕中纖維素的消化率。陸豫等(2007)使用白地霉和米曲霉脫毒菜籽粕，水料比2：1，29℃發酵47 h，硫甙去除率達到97%，取得了較好的效果。但是，國內外的大部分菜籽粕微生物發酸菌種并不是我國農業部(2006)允許在飼料中使用的品種 ，而且近年來對菜籽粕發酵多數以硫甙脫毒和提高蛋白含量等方面為主要研究目標，發酵工藝主要采用100℃以上高溫滅菌，雖也能去除抗營養因子，但能源消耗大，蛋白質品質也難以保證。另外，對微生物法降解菜籽粕中的植酸、單寧等抗營養因子的研究報道也較少。

1.2.1.3 發酵豆粕

發酵豆粕與豆粕相比，能有效去除豆粕中熱不敏感的抗營養因子，如抗原蛋白、植酸以及水蘇糖等，尤其抗原蛋白具有抗原性和致敏性，能刺激免疫系統產生抗體，導致腹瀉和生長受阻。通常熱敏性抗營養因子在油脂加工過程中通過熱處理已經大部分除去，如胰蛋白酶抑制因子、脲酶以及大豆凝集素等(姚琨等,2011)。李建(2009)研究表明，通過熱處理胰蛋白抑制因子可從10～15 mg/g降低至1 mg/g以下。通過發酵處理，豆粕中的植酸、抗原蛋白等“熱不敏感”抗營養因子都得到顯著去除。胥九兵等(2008)發現,產蛋白酶的芽孢桿菌對抗原蛋白降解效果較好,降解率在90%以上。姜丹等(2011)發現，酵母菌單菌發酵豆粕后，胰蛋白酶抑制因子降低了58.27%，植酸降低了80.11%，豆粕中粗纖維含量也顯著降低。陳潔梅等（2011）發現，發酵后大豆抗原已經完全被分解，各種主要抗營養因子的降解率達90%以上。

1.2.2 提高真蛋白質(小肽、氨基酸)含量和消化利用率

發酵過程中，微生物大量繁殖，將培養基中的非蛋白氮、無機氮、碳源及抗營養因子等各種物質分解利用轉化為營養價值高的菌體蛋白。同時，通過微生物的降解，可將部分大分子的蛋白質降解為具有特殊功能的營養小肽和氨基酸。

莫重文等(2007)研究發現,米曲霉和酵母混合發酵豆粕中粗蛋白含量可達49.10%,比原料中增加12.1%。王金斌等（2009）研究發現，枯草芽孢桿菌M5094和熱帶假絲酵母C3161發酵豆粕，基質粗蛋白含量由31.75%上升到49.27%。陳潔梅等(2011)利用芽孢桿菌對豆粕進行固態發酵試驗，發現樣品中粗蛋白含量從50.6%增加到54.1%,TCA-N含量從2.4%增加到38.8%,大豆肽含量從1.8%提高到29.5%，游離氨基酸含量從5.57 mg/g增加到92.65 mg/g，大分子蛋白質基本上都被降解成10 kD以下的小分子肽，這與吳寶昌(2010)、錢森和等(2011)、姜丹等(2011)、劉曉艷等(2011)研究結果一致。常磊等(2011)使用飼用酶與芽孢桿菌協同作用發酵豆粕,其酸溶性蛋白含量從2.74%增加到24.55%，乳酸含量從1.26%增加到4.70%，各種抗營養因子也大都得到降解，大分子蛋白降低至20 kD以下。傅玨等研究發現，發酵增效劑Ⅲ提高發酵豆粕肽含量的能力最強，在較優水平即：添加量5 kg/t、料水比3：7、39℃條件下，發酵豆粕產肽量達19.67%，較空白組提高了208.31%。

張慶華等采用熱帶假絲酵母、擬內胞霉和植物乳桿菌協同固態發酵棉粕，粗蛋白含量從30.05%提高到34.50%。吳偉偉等研究了黑曲霉與釀酒酵母混合固態發酵棉籽餅粕，真蛋白質含量從32.99%提高到42.40%，必需氨基酸中賴氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸含量分別較發酵前相比增加了31.03%、25.00%和44.23%。賈曉鋒等(2008、2009)采用黑曲霉和熱帶假絲酵母發酵棉籽粕，黑曲霉具有較強的蛋白降解能力，可將高分子質量的棉籽蛋白降解為14 Ku以下的小分子蛋白和小分子肽。劉俊等(2010)研究發現，混菌發酵后棉粕TCA-NSI(三氯乙酸氮溶指數)提高了25.34%,小分子多肽含量提高了11%,游離必需氨基酸提高了24%。劉俊(2011)的研究進一步發現，棉粕經混菌發酵后氨基酸組成更趨于平衡，這也與蔣金津(2010)、夏新成等(2010)、諸葛斌等(2011)、金紅春(2011)等研究結論一致。蔣金津(2010)發現，棉粕和發酵棉粕在肉仔雞消化道內水解釋放小分子肽的比例有顯著差異，其比例高低為：發酵棉粕＞發酵棉蛋白＞棉蛋白＞棉粕＞魚粉＞酶解棉蛋白＞酶解棉粕＞豆粕。

1.2.3 增加飼料中酶類、益生菌等生物活性物質含量

發酵植物蛋白較之普通植物蛋白多了很多生物活性因子，對促進動物生長，提高動物飼料轉化效率等有積極作用。同時，產品中含有的大量酵母菌體等益生菌，可改善動物的腸道微生態，提高動物免疫力。

金紅春(2011)研究證實，棉粕經過發酵后，淀粉酶活力提高了766 U/g、纖維素酶活力提高了494 U/g、脂肪酶活力提高了249 U/g。徐晶等(2012)研究發現，發酵后棉粕中蛋白酶含量為664.17 U/g,淀粉酶含量為471.73 U/g,酵母菌含量為2×106cfu/g，芽孢桿菌含量為1.3×108cfu/g。邱良偉(2012)研究發現，發酵棉粕中芽孢桿菌和酵母菌的總活菌數可達4.6×108cfu/g。劉天蒙(2011)發現，米曲霉固態發酵豆粕產生的蛋白酶酶活最高為 975.74 U/g。吳寶昌(2010)、熊濤等(2011)、陳潔梅等(2011)利用枯草芽孢桿菌與其他菌混菌發酵后，豆粕中酶活大大提高。

1.3 發酵蛋白飼料的應用效果

發酵類產品在飼用過程中的優勢主要表現在：提高日增重、改善飼料品質、改善養殖環境、改善動物健康等。

禚梅等（2012）研究日糧中添加棉仁蛋白、發酵棉粕以及發酵棉粕+能量代替豆粕對蛋雞產蛋后期生產性能的影響,發現日糧中添加5%發酵棉粕代替豆粕組產蛋后期蛋雞的產蛋率、料蛋比、體重增長、經濟效益指標優于其他組。陳道仁等(2010)、朱獻章等(2010)、湯江武等(2011)在魚、豬、肉雞日糧中添加發酵棉粕也得到了較好的應用結果。劉海燕(2010)、劉欣等(2007)發現，發酵豆粕可促進仔豬生長、增強仔豬免疫力、提高飼料轉化效率。游金明（2008）、季天榮等(2008)、胡永娜等（2012）研究了發酵菜粕替代豆粕在肉雞、斷奶仔豬日糧中的應用效果，也得出相似的結論。

1.4 發酵蛋白飼料存在的問題

①發酵原料的安全性：如豆粕和花生粕中可能存在的黃曲霉毒素。

②發酵所用微生物的安全性：固態發酵棉粕環境相對開放，在發酵過程中容易感染其他雜菌，甚至是有害菌。

③產品質量的穩定性：由于固態發酵工藝本身的開放式操作，對發酵時間、溫度、水分控制等大都靠生產人員的經驗，因此，保證產品質量的穩定是關鍵。

④相應的質量評價標準的制定：市場上的產品良莠不齊，但由于缺乏相應的質量評價標準，使得消費者很難辨別真偽。

⑤不同動物飼糧中最適添加比例的確定：發酵植物性蛋白飼料原料是以植物蛋白為原料的產品，其氨基酸組成和含量千差萬別。如何確定發酵植物蛋白類飼料種類及其在飼料中的最佳使用比例、降低飼料成本等問題還有待于科研部門深入探索、生產廠家不斷完善工藝和廣大用戶不斷積累經驗。

⑥加工設備低、水平重復、開發能力不足、標準水平低：目前的實際生產大都采用通用加工設備，技術相對落后、生產環境惡劣、勞動強度大、對物料的適應性差、產品質量不穩定、生產規模小、自動化程度低，不能完全適應生物飼料加工的需要，這些已成為發酵類飼料生產和發展的制約因素（高翔，2011）。

2 酶解植物蛋白飼料資源

酶解是指在適宜的條件下利用酶的作用，將大分子物質降解為小分子物質的過程。酶法水解蛋白較酸、堿水解法具有許多無可比擬的優點，如反應條件溫和、產品純度高、不產生消旋作用、不破壞氨基酸,其主要產物是肽而不是氨基酸等(劉靜，2006、2010)。

2.1 酶解方式

酶解蛋白飼料有兩種生產方式，一種是直接在原料中添加特定的酶，并將條件調整到該酶的最適條件，以得到預期產物。目前常用的酶主要有：Alcalase堿性蛋白酶、Flavourzyme復合風味酶、Protease A和Peptidase R、胃-胰蛋白酶等。另一種酶解是指通過微生物發酵產酶直接酶解蛋白質飼料資源，一般通過篩選適宜在蛋白質底物上優良表達的菌株，以菌株分泌的蛋白酶在體外將蛋白質酶切成長短不一的肽段。由于菌株代謝產物往往不是某種單一確定的酶，微生物發酵降解蛋白質的同時往往還具有脫毒、除去餅粕中的抗營養因子等能力。

2.2 酶解的研究及應用現狀

微生物發酵酶解法在大豆肽生產中技術較成熟，也得到了較廣泛的應用。目前采用的微生物主要有：嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、米曲霉、黑曲霉等。米曲霉降解豆粕的效果最好，芽孢菌則能繁殖出大量的以芽孢形式存在的益生菌，而采用嗜酸乳桿菌發酵豆粕使產物粗蛋白含量有所提高(3.49%)。王文娟等（2007）采用黑曲霉發酵大豆餅粕也取得了良好效果，獲得的大豆蛋白混合肽含量達60%以上。微生物發酵法生產小肽具有復合酶解作用，例如部分菌株還能同時去除小肽苦味。萬琦等(2003)報道了1株用于大豆肽的枯草芽孢桿菌產羧肽酶，將短肽末端的疏水性氨基酸切除，從而實現了酶解和脫苦一步完成的大豆多肽發酵生產。郭濤等（2005）發現，中性蛋白酶AS1.398水解菜籽蛋白酶解后有75%左右的蛋白質轉化為可溶性肽。通常復合酶解效果要優于單一酶解，如Alcalase堿性蛋白酶和Flavourzyme復合風味酶雙酶對菜籽清蛋白進行分步水解能將水解度由單酶的14.72%提高至 28.10%。周乃繼（2009）、蔣金津等（2010）建立了Alcalase酶和Flavourzyme酶復合酶解棉、菜籽粕的復合酶解工藝，并分別成功制成酶解棉籽粕和酶解菜籽粕產品。酶解大豆、花生、玉米肽雖然已在食品工業中得到應用，但由于生產成本偏高，在飼料工業中的應用仍有局限性。

2.3 酶解飼料蛋白資源存在的問題

酶法水解蛋白的主要目的產物是各種功能性小肽。小肽制品高度安全且性能卓越，既有豐富的營養性作用又有防病抗病等功能作用，可以預見，肽制劑將成為繼維生素、氨基酸后在飼料中又一種必不可少的添加物。因此，探討小肽的轉運、吸收、代謝及其作用形式可為進一步發展蛋白質營養理論開辟一條新路，研究如何降低酶解成本，著手開發和研制廉價、高效、安全和無污染的小肽制品并應用于畜牧業生產實踐，對于更加充分地利用蛋白質資源，改變我國蛋白質資源短缺局面，提高畜牧業及水產業整體生產水平有很大的益處。另外，酶解小肽的評價標準以及對功能性肽的認定也很關鍵。由于肽類物質具有許多生理活性，國外對各類食品用肽產品開發與應用方面的研究非?；钴S,研究范圍廣泛,因此，系統建立蛋白肽評價體系也是當務之急。

3 發酵與酶解植物性蛋白飼料研究進展與發展方向

發酵和酶解都屬于在植物性蛋白飼料資源開發利用中的生物技術手段，統稱為生物蛋白飼料，兩種技術都極大地改善了植物蛋白飼料的營養特性，擴大了其在飼料中的應用范圍。我國的發酵工業已取得了長足的發展，微生物發酵對大豆、棉籽及菜籽餅粕中的有毒、有害物質及抗營養因子的去除效果明顯，對蛋白質大分子降解為小肽等的作用顯著，能提高蛋白質及NSP類營養物質的消化利用率，達到節約飼料消耗的目的。通過新型發酵豆粕、棉粕及菜粕等產品開發，

不僅能使餅粕中抗營養因子及有毒、有害物質進一步降低到一個最低的水平，而且能使餅粕總蛋白分子的肽鍵降解50%以上，這在開發小肽營養產品和功能性肽產品方面將有很大的潛力。另外，應用生物技術如酶工程技術，可開發高蛋白質含量的濃縮蛋白等系列產品，如大豆、棉籽、菜籽濃縮蛋白（CP≥65%），這也將進一步擴大餅粕飼料產品的用途。總之，以植物蛋白生產的新型生物蛋白飼料作為一個新型的飼料資源，無論從理論上還是實踐上，均需要進一步發展和完善，尤其在檢測技術、評價技術、摻雜使假的防控上應引起各方重視。隨著微生物學、飼料學等眾多學科的交叉發展，菌體蛋白開發技術將會有所飛躍，這對緩解我國飼料原料緊張的局面，推動飼料工業和畜牧業的發展都具有廣闊的前景。

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