益生菌類飼料添加劑概述

喻 婷鄧 兵張金鳳錢運國王麗霞周 華楊 宇葉勝強童偉文冉志平

（1.武漢市畜牧獸醫科學研究所，湖北武漢430208；2.武漢多寶微生物技術有限公司，湖北武漢 430312）

提高肉類產品的品質和安全性是畜牧研究的一個重要方向。在過去的幾十年里，抗生素被用作動物飼料添加劑抑制畜牧業疾病的爆發（Dibner等，2005）。然而，隨著世界范圍內人們越來越關注耐藥菌產生和耐藥基因傳遞的問題（Mathur等，2005；Salyers等，2004），歐盟在2006年1月1日起，禁止抗生素作為生長促進劑（AGP）在飼料中使用。動物飼料禁止使用抗生素后，一個主要的結果就是家畜壞死性腸炎在禁止使用抗生素生長促進劑的國家里有增加的趨勢，治療劑量的抗生素使用量增加(Casewell等，2003；Van Immerseel等，2004)，家禽產業受到了巨大的壓力。

益生菌類飼料添加劑作為替代方案逐漸被人們所接受。它能夠增強動物的天然防御機制，減少抗生素的大量使用。腸道內的微生態系統對宿主健康起著非常重要的調節作用(Tuohy等，2005)。腸道內微生態平衡能夠有效抑制致病菌的生長，產生對機體有益的代謝產物（如維生素、短鏈脂肪酸等），并通過激活免疫系統抑制腸道炎癥。

1 理想的益生菌

Fuller（1989）指出好的益生菌的特性：①是一個確定的菌株，并能在宿主動物體內發揮有益的作用，如促進生長或抑制疾病；②沒有致病性，不產生毒素；③是活細胞，容易擴增；④能夠適應腸道這種低pH值、含有大量的有機酸和膽汁的環境；⑤在普通條件下穩定，不易失活(Oyetayo VO等，2005)。同時益生菌還應該具有有益的生理效果，并證明對人是安全的，并能有效地黏附于腸道組織(Salminen,1998)。

1.1 乳桿菌屬（Lactobacillus）

乳桿菌屬是一個非常廣泛的由多種菌組成的分類學單位，它包含100種以上的不同種菌，都屬于乳酸產生菌（LAB）類。很多乳桿菌都是人和動物腸道微生物的重要組成菌，它們的存在是宿主所必需的。該屬中的多種菌已被應用于食物和發酵產品中，被人和動物食用(Hammes,2007)。僅有非常少的報道說乳酸菌與人疾病有關，主要集中在L.casei和 L.rhamnosus。乳桿菌在動物中沒有發現安全性問題。由于乳桿菌長期使用的歷史，歐洲食品安全委員會（EFSA）提出一系列安全合格(QPS)的益生菌（見表1）(EFSA,2007)。

1.2 腸球菌屬（Enterococcus）

腸球菌屬屬于乳酸菌類益生菌。腸球菌在天然食物制品中被發現，是人和動物腸道中的正常菌群。屎腸球菌（E.faecium）和糞腸球菌（E.faecalis）是人類腸道中最常見的兩種菌，而動物腸道內，以屎腸球菌為主（Fisher等，2009）。這些益生菌被用于食物生產，如奶酪中作為益生菌，或作為青貯飼料添加物(Foulquie等，2006)。

1.3 芽孢菌屬（Bacillus）

芽孢菌屬是產芽孢的革蘭氏陽性菌，普遍存在于土壤、水和空氣中。芽孢菌屬正常情況下并不是腸道微生物，是由于吃了染有芽孢菌的食物被帶入腸道。有些芽孢菌屬的芽孢被用作動物飼料添加劑、益生菌、替代農藥保護植物和種子，但應用活的芽孢作為益生菌添加劑會出現一些問題，尤其是安全性問題（Sanders等，2003）。由于某些芽孢菌在動物飼料中的添加，使得它們的安全性得到EFSA的認可(EFSA，2007a)(表1)。由于很多芽孢菌屬的細菌有潛在的產毒特性，所以作為益生菌的芽孢菌一定要確定其安全無毒素。

表1 質量安全的益生菌（數據來自歐洲食品安全委員會）

1.4 酵母菌屬（Saccharomyces）

酵母菌屬于腸道微生物。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）普遍存在于自然界，在植物、水果和土壤中都能找到它的身影。釀酒酵母也存在于食物和發酵飲料中。S.boulardii是從荔枝皮中分離到的，它在分類學上并不很明確，它的生物特性類似于釀酒酵母。S.boulardii作為益生菌常被用于反芻動物和豬的飼養中。

2 益生菌的作用機制

益生菌主要通過3種機制促進機體健康：①改善腸道微生態環境；②附著于腸道黏膜表面，與腸道黏膜一同保護機體免受病原體感染；③通過與腸相關的免疫系統相互作用，調節免疫應答(Hooper等，2001)。目前的研究顯示，每種腸道菌在促進宿主健康中都發揮著各自的作用。

2.1 腸道微生物群

動物腸道內的微生物群由多種微生物組成，其細胞數目可達1014個，具有非常廣泛的生物多樣性。在正常情況下，這些共生的益生菌為宿主提供營養，維持腸道內環境穩定。它們通過產生抑菌物質、封閉黏附位點、表達抗侵襲和抗毒素以及競爭限制性資源來抑制病原菌的感染。例如，腸道菌通過調節腸道pH值、氧化還原劑以及產生硫化氫等來產生抑制病原菌生長的抑制性環境。體外研究顯示，益生菌產生的一些小分子物質，如乳酸、過氧化氫等，都能夠抑制細菌的繁殖(Oelschlaeger,2010；Ng等，2009)。細菌素類物質是一類抗菌蛋白，分子量大于20 kDa，由乳酸桿菌和雙歧桿菌的細菌產生。細菌素能夠抑制乳酸桿菌外的其它細菌生長，甚至包括酵母菌和霉菌的生長。細菌素分為低分子量細菌素（LMWBs）和高分子量肽。其它一些益生菌也能產生抗菌物質。路氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）產生的reuterin(又名3-羧基丙醛)是一種廣譜的抗生素,不但可以抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌,而且對酵母、霉菌、原生動物和病毒都有抑制活性(Cleusix 等，2008；Schaefer等，2010)。益生菌通過消耗限制性營養物抑制潛在微生物的生長。如鐵離子的消耗是大多數細菌所必需的，Lactobacillus acidophilus和Lactobacillus delbrueckii可將鐵氧化物結合于細胞表面,E.coli Nissle也可螯合高鐵或二價鐵離子(Grosse等，2006)。某些益生菌能夠抑制致病菌產生的毒素。Lactobacillus spp.可抑制腸出血性大腸桿菌E.coli O157:H7毒素Shiga toxin 2A，后者會引起宿主腹瀉。Saccharomyces boulardii可抑制C.difficile毒素A通過ERK1/2和JNK/SAPK通路引起的炎癥反應(Chen等，2006)，并可誘導產生特異性抗毒素A的IgA免疫應答和分泌針對毒素的蛋白酶(Qamar等，2001)。

2.2 促進腸道黏膜屏障完整性

益生菌黏附在腸道表皮黏膜，與表層蛋白受體接合，并通過提高黏蛋白和表面活性劑的分泌、降解腸道表面受體上的糖基、模擬寡糖受體等方式競爭腸道表面相似的受體，抑制致病微生物黏附(Oelschlaeger,2010)。益生菌通過介導黏蛋白表達、增強表皮細胞糖基化、增加分泌型IgA表達以及產生短鏈脂肪酸等方式增強腸道黏膜屏障。研究發現，短鏈脂肪酸具有促進腸道表皮細胞增殖、腸道黏蛋白產生、胰酶分泌和腸道蠕動等功能 (Isolauri等，2004；Wallace 等，2011)。而且，很多現象表明，益生菌通過調控細胞骨架和緊密連接蛋白磷酸化來維持腸道屏障完整性。Streptococcus salivarius var.thermophilus和L.acidophilus可增加肌動蛋白和閉合素蛋白的磷酸化 (Resta-Lenert and Barrett)；腸致病性大腸桿菌可使T-84表皮單層細胞裂解，E.coli Nissle 1917通過改變蛋白激酶C信號導致帶狀閉合蛋白-2的重排和放大，阻斷腸致病性大腸桿菌的致病作用(Zyrek等，2007)。

2.3 對宿主免疫的調節

腸道益生菌持續與腸免疫系統相互作用，而免疫系統對益生菌刺激產生的信號和病原菌刺激產生的信號不同，所以益生菌刺激免疫系統后能起到保護作用(MacPherson等，2004)。研究顯示，益生菌可誘導機體產生天然免疫應答和獲得性免疫應答，使宿主分泌sIgA量增加、NK細胞活性增強，并且轉錄因子NF-кB和激活蛋白-1的活化而使細胞因子過表達(Kim等，2008)。同時也會表達免疫抑制類的因子，如具抗炎活性的IL-10、TGF-β以及激活Th細胞等（Rachmilewitz等，2004；Di等，2005）。益生菌還可通過與腸道表皮細胞膜上的Toll樣受體相互作用發揮調節作用，并可調節腸道表皮細胞的凋亡前應答。益生菌與表皮細胞共培養，能夠激活抗凋亡作用的Akt/蛋白激酶PKB，并通過TNF-α抑制前凋亡蛋白P38/絲裂原活性蛋白激酶（Neish等，2000）。但需要強調的是益生菌抑制凋亡的活性是短期的（Ukena等，2005）。

某些屬的益生菌對免疫有特殊的調節活性。Lactobacillus rhamnosus GG能夠下調 E.coli和 Bacteroides ovatus刺激產生的IL-8的水平(Zhang等,2005)。Lactobacillus casei能下調泛素-蛋白酶體通路相關的NF-кB介導的前炎癥信號（Ng等，2009）。在其他的研究中，許多益生菌屬都具有很好的抗炎活性。Lactobacillus spp.和Bifidobacterium spp.激活巨噬細胞產生大量的NO和前炎癥細胞因子和抗病毒活性因子(Ivec等，2007)。此外，乳酸菌屬通過誘導IL-12顯著提高了NK細胞活性(Takeda等,2006)。研究發現，益生菌可以上調機體防御素的量。防御素是機體產生的天然抗菌肽。某些益生菌,如E.coli Nissle 1917、L.acidophilus、Lactobacillus fermentum 和 Pediococcus pentosaceus介導表達人防御素-2（Kabeerdoss等，2011）。

3 益生菌在養殖業上的應用

在小豬斷奶期間，會涉及到腸道微生態環境的變化、營養組成的改變，時常會出現腹瀉，影響小豬的生長和健康，這種腹瀉是在仔豬斷奶后第1周最容易出現的問題。過去，飼料中加入抗生素和金屬離子（銅和鋅）以防止斷奶的仔豬腹瀉。但由于抗生素大量使用引起耐藥基因的擴散和耐藥菌的增加，金屬離子大量使用對環境壓力日益增大，益生菌作為減少抗生素使用的替代方法越來越受到人們的關注。益生菌的使用可以減少病原菌的數量，改善腸道疾病，對斷奶后仔豬的腸道機能失調的現象有很好的預防和治療作用。

大量研究表明，新生小豬在使用益生菌制劑后能夠明顯降低腸毒性大腸桿菌引起的死亡（Genovese等，2003）。腸球菌（Enterococcus）是天然存在于動物腸道中的細菌。小豬從出生到斷奶每日經口服屎腸球菌(Enterococcus faecium),可提高日增重并減少腹瀉的發生(Zeyner等，2006)。腸球菌 E.faecium SF68，作為抗生素替代療法被用于治療痢疾(Bellomo等，1980；Lewenstein等，1979)。體外實驗顯示，它能夠明顯的抑制大腸桿菌、沙門菌屬、志賀菌屬和腸桿菌屬的生長(Can－ganella等，1996;Lewenstein等，1979)。作為益生菌，E.faecium SF68能夠在腸道內很好的生存。Spieler等（1996）的研究顯示，E.faecium SF68能夠通過豬的腸道并保持活性，在豬糞中，該菌的數量可達濕重1.8×108個/g。乳桿菌也是豬腸道內存在的常見菌，在小豬飼料中添加乳酸桿菌能夠明顯增加斷奶后小豬腸道的乳酸菌數量，有益于小豬的健康，提高其存活率(Takahashi等，2007)。如L.rhamnosus GG能夠有效改善小豬斷奶后由E.coli K88引起的腹瀉，調節腸道內微生態平衡，增強腸道特異性免疫，調節炎癥細胞因子的產生(Zhang等，2010)。

在家禽飼養過程中，由于孵化條件、運輸、飼料和飼養密度等原因，會出現免疫功能差，容易被腸道致病菌感染，從而影響家禽健康和食品安全的問題。腸炎沙門氏菌、空腸彎曲菌和產氣莢膜菌都易感染雞并通過食物鏈傳播的致病菌，嚴重威脅著家禽和人們的健康(Humphrey等，2007)。益生菌抑制致病菌感染的策略能夠維持腸道微生態平衡和宿主健康。家禽中益生菌的使用主要利用了益生菌對致病菌的競爭排斥。給剛孵化的小雞使用益生菌能夠成功地控制和減少沙門氏菌在腸道表面的生長，此外，益生菌的使用還能夠保護小雞，抑制空腸彎曲菌、利斯塔氏單胞菌、致病性大腸桿菌、小腸結腸炎耶爾森菌和產氣莢膜芽孢梭菌等的感染(Nisbet,2002;Schneitz,2005)。

大量的性狀優異的益生菌株被用于調節禽腸道菌群并抑制致病菌在腸道內生長，特別是乳酸桿菌的應用研究。研究主要針對菌種的體外篩選、黏附特性和抗微生物活性等（Patterson等，2003）。研究顯示，乳桿菌為主的益生菌制劑能夠有效幫助Salmonella enteritidis感染后小雞腸道健康的恢復，減少致死。新孵化1 d的小雞接種腸致病菌后，口服乳桿菌，能夠使致死率從60%降低到30%（Hofacre等，2003）。乳桿菌的使用減少了扁桃體和盲腸內S.enteritidis的數量（Higgins等，2007）。乳桿菌L.johnsonii F19185對S.enteritidis也有相似的結果，同時對腸道中E.coli O78K80和Clostridium perfringens的生長也有顯著的抑制（La等，2004）。一些研究顯示，給剛孵化的小雞喂食產芽孢益生菌的芽孢，如B.cereus var.toyoi，也能夠降低S.enteritidis在腸道內的侵入和定植（Vila等，2009）。

益生菌的使用，不僅減少了致病菌對家禽的感染，有效控制食物傳播疾病的發生，同時其營養作用對家禽的生長性狀也有明顯的促進作用,如增加屠體重,改善飼料轉化率和肉質等。總的來說,益生菌制劑加入飼料中或是飲水中都能起到生長促進劑的作用，調節腸道菌群平衡及酶活力,促進腸道健康（Timmerman 等,2006）。研究報道，Lactobacillus acidophilus、L.casei、Bifdobacterium thermophilus和 Enterococcus faecium能夠提高產蛋量和蛋的質量，并降低蛋雞飼料消耗（Davis等，2002；Kurtoglu等，2004；Panda等，2008)。

4 結論

在世界范圍內，抗生素作為飼料添加劑抑制養殖業疾病發生已經有50多年的歷史。自從歐盟2006年1月起全面禁止后，盡管國內養殖業中抗生素仍在大量使用，但益生菌使用的比例也在逐年增加。從動物健康和福利、食品安全及人畜共患病的控制等方面考慮，益生菌在養殖業中的使用意義重大。與抗生素相比，益生菌在生產階段的使用能夠改善家畜營養吸收，增加飼料攝入和體重，抑制致病菌的生長和傳播。益生菌的使用減少了致病菌，尤其是多重耐藥菌在食物鏈中傳播，有利于食品安全生產和人們的健康。

腸道微生物對維持腸道健康有著重要的作用，腸道中的微生物菌群具有多樣性和相對穩定性的特點，它們通過與腸道黏膜的接觸調節腸道免疫系統，并抑制外來致病菌感染和腸道疾病的發生。益生菌并非像抗生素一樣通過殺死致病菌，而是通過調節腸道內環境，降低腸道疾病發生的風險，并通過調節機體免疫系統來減少疾病發生。雖然益生菌在致病菌感染后具有一定的治療作用，但益生菌對于疾病發生的預防作用更為突出。

除了在疾病控制方面的應用外，益生菌在動物營養方面的價值也很突出。益生菌能夠將飼料中的粗蛋白、纖維、脂肪酸分解為小分子物質，并產生大量的對機體健康有利的代謝產物，提高了飼料的利用率和營養價值，有效地促進動物的生長性能和健康狀況。

很多屬和種的益生菌都有相當長的食用歷史，被證明是安全可靠的，然而在某些特定的屬，如腸球菌屬和桿菌屬中，也存在能夠引起疾病的細菌，在使用中應該更為慎重。