凋亡素VP3蛋白的原核表達及純化

鄧守恒，柯賢柱，石小燕，蔡召忠，楊敬寧，黃永章，陳 萍

(1湖北醫藥學院附屬人民醫院腫瘤中心，湖北十堰442000;2武漢市中心醫院; 3湖北醫藥學院免疫教研室)

雞貧血病毒(CAV)VP3基因是近年發現的凋亡誘導基因，可特異性地誘導人類多種腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞無影響［1］，在腫瘤治療中受到國內外研究者的關注。目前的研究多集中于VP3基因對腫瘤細胞的作用［2，3］，很少有VP3蛋白抗腫瘤作用的報道。2010～2011年，本研究采用靶向克隆法成功構建pET15b-VP3原核表達質粒，誘導表達并純化VP3蛋白，為深入研究VP3蛋白的結構、功能、藥理作用及臨床應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 ①菌株、質粒和引物:PGEX-6P-1/TATVP3質粒(昆明醫學院王劍松教授惠贈)，線性pET15b、大腸桿菌DH5a、E.coliRosetta(十堰市人民醫院臨床醫學研究所提供)。PCR引物由上海生工公司合成。②試劑:限制性內切酶XhoⅠ、BamHⅠ(美國)，AdvantageR2 Polymerase Mix(大連)，DNA片段純化試劑盒、200堿基對標準DNA(北京)。靶向克隆酶試劑盒(美國Loopile公司)，Ni2+-氮基三乙酸瓊脂糖親和層析柱(美國Bio公司)，Western blotting檢測試劑盒(KPL公司)。③主要儀器:PCR儀(德國)，凝膠圖像分析系儀(天呈科技公司)，凝膠電泳儀(大連)，核酸蛋白檢測儀(上海)。

1.2 方法

1.2.1 pET15b-VP3重組質粒構建 以PGEX-6P-1/TAT-VP3質粒為模板，利用引物進行PCR擴增。擴增條件:起始變性95℃1 min;然后95℃30 s、68℃3 min，35個循環;最后68℃延伸3 min。PCR產物電泳鑒定，低熔點瓊脂糖凝膠電泳并回收純化366 bp的VP3 cDNA片段，運用靶向克隆酶，將純化后的VP3 cDNA與末端序列相同的線性pET15b進行同源重組，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5a，并涂布到含氨芐青霉素(100 μg/mL)的TB培養基上16 h，選單個菌落接種于含氨芐青霉素(100 μg/ mL)的TB培養基上培養24 h，少量提取質粒，通過XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定;然后將pET15b-VP3重組質粒送上海生工公司測序鑒定。

1.2.2 VP3蛋白表達 將pET15b-VP3重組質粒分別轉化 E.coliRosetta，鋪在含氨芐青霉素(100 μg/mL)的TB培養基上16 h，挑取單個菌落至200 mL含氨芐青霉素(100 μg/mL)的TB培養基中37℃放大培養，當細菌生長至A600為0.5～1.0時，加入0.83 mol/L IPTG至終濃度0.83 mol/L，置25℃誘導培養12 h。

1.2.3 VP3蛋白純化 將上述菌液在4℃、5 000 r/min離心4 min后，棄上清收集菌體，用PBS洗滌3次，將菌體溶于50 mL緩沖液 A(1×PBS，20 mmol/L咪唑，6 mol/L尿素，pH 8)中，400 W、10 min、間隔5 min，4℃超聲破菌41 min。將破菌完全的較澄清菌液置于超速冷凍離心機中，20 000 r/ min、4℃離心10 min后，收集上清液;將上清液緩慢加入Ni2+-氮基三乙酸瓊脂糖親和層析柱，上樣完畢后，雜交結合3 h，用10倍體積的緩沖液A過柱，洗去未結合的雜蛋白;最后用洗脫緩沖液B(1×PBS，500 mmol/L咪唑，6 mol/L尿素，pH 7.5)將VP3蛋白洗脫下來。

1.2.4 VP3蛋白的SDS-PAGE、Western blotting鑒定 收集洗脫峰值的洗脫液行12%SDS-PAGE，將電泳后凝膠置于考馬斯亮藍R-250液中染色，拍照后100 mA轉膜2 h，在膜上加入兔抗多聚組氨酸抗體(1∶1 000)于室溫下孵育過夜;加入山羊抗兔抗體(1∶10 000)于室溫下孵育2 h，用ECL顯影。將含有VP3蛋白的洗脫液依次置于4 mol/L尿素12 h、2 mol/L尿素12 h、3次1×PBS各24 h中4℃透析脫鹽，用直徑0.22 μm的一次性濾器過濾透析后的蛋白，以牛血清白蛋白做對照，用Bradford法測定VP3蛋白濃度。

2 結果

2.1 VP3基因 PCR擴增結果 以 PGEX-6P-1/ TAT-VP3質粒為模板，用VP3上、下游引物行PCR擴增，將PCR擴增產物行1.2%普通瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線下可見擴增出366 bp的特異性VP3片段。

2.2 pET15b-VP3原核表達質粒構建、酶切和測序鑒定結果 XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定顯示，在靶向克隆酶作用下，陽性克隆中含有長度約5 700 bp的pET15b和366 bp的VP3條帶;測序結果表明，VP3cDNA序列成功克隆入了pET15b，且其序列與GeneBank中的 VP3 CDNA序列完全一致，證明pET15b-VP3原核表達質粒構建成功。

2.3 VP3蛋白在大腸菌中的表達、純化與鑒定 麗春紅染色后發現，參照標準分子量蛋白，可見有13.6 kD的VP3目標條帶，Western blotting分析表明此目標條帶即VP3蛋白;Bradford法測得VP3蛋白的產量約為9.53 mg/100 mL菌液。

3 討論

CAV屬圓環病毒科圓環病毒屬，其基因組全長約2.3 kb，組成環狀負鏈DNA，有3個部分或完全重疊的開放閱讀框，分別編碼VP1(51.6 kD)、VP2 (24.0 kD)、VP3(13.6 kD)3種蛋白［4，5］。VP3和VP2的開放閱讀框相互重疊，其編碼基因全長366 bp，在各病毒株之間同源性較高。有研究表明，VP3可通過獨立于p53的作用途徑、不被Bcl-2抑制的方式選擇性地誘導人轉化細胞和腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞無毒性作用，因而VP3基因被稱為腫瘤特異性凋亡基因，其表達的 VP3蛋白稱為凋亡素［6，7］。

本研究采用基因工程手段制備VP3蛋白，解決了正確構建pET15b-VP3重組質粒、使pET15b-VP3重組質粒在宿主菌中表達的目的蛋白能進行有效地分離和純化的兩個關鍵問題。第一，本研究采用最新的靶向克隆法進行構建，在PCR上、下游引物中分別加上XhoⅠ、BamHⅠ酶切位點，還設計了部分與線性化載體pET15b切口兩端同源的序列，以使目的基因擴增產物經雙酶切后能與載體進行靶向同源重組;并在PCR反應中用AdvantageR2 Polymerase Mix，其保真度是標準TaqDNA聚合酶的3倍以上，可有效地降低PCR反應中的錯配率，獲得較高的產量。獲得的陽性克隆經酶切和測序鑒定后證實，pET15b-VP3重組質粒構建成功，VP3 cDNA編碼區成功地克隆入了pET15b。第二，本研究選用的運載體是pET15b，其作為運載體所表達的基因工程重組蛋白在其N端帶有一個由6個組氨酸組成的“標簽”，可在Ni2+-NTA-樹脂柱進行親合層析吸附，方便后期對表達蛋白進行分離和純化［8］。純化后的蛋白經SDS-PAGE和Western blotting檢測，顯示出特異性的VP3蛋白條帶，且其蛋白相對分子量為13.6 kD，表明凋亡素VP3蛋白表達及分離純化成功。

［1］Oro C，Jans DA.The tumour specific pro-apoptotic factor apoptin (VP3)from chicken anaemia virus［J］.Curr Drug Targets，2004，5 (2):179-190.

［2］曹紅丹，向延秀，呂琳，等.VP3和TRAIL基因共表達沙門菌載體對胃癌細胞生長作用的影響［J］.腫瘤，2009，29(1):11-14.

［3］袁順輝，王劍松，李澤惠，等.VP3基因聯合吉西他濱誘導人膀胱癌細胞凋亡的實驗研究［J］.現代泌尿外科雜志，2009，14(3): 193-196.

［4］劉澤文，徐滌平，周平華，等.競爭性PCR定量檢測雞傳染性貧血病毒核酸［J］.中國預防獸醫學報，2005，(3):227-229

［5］殷震，劉景華.動物病毒學［M］.2版.北京:科學出版社，1997: 1175-1180.

［6］Danen vail Oorschot AA，van Der Eb AJ，Notebom MH.The chicken anemia virus derived protein apoptin requires activation of caspases for induction of apoptosls in human tumor cells［J］.JVirol，2000，74(15):7072-7078.

［7］Danen-vaI1 Oorschot AA，Fischer DF，Grimbergen JM，et al.Apoptin induces apoptosis in hum an transformed an d malignantcells but not in norm al cells［J］.Proc Nad Acad Sci USA，1997，94 (11):5843-5847.

［8］陳長華，黃華，龔健，等.大腸桿菌His6融合表達載體及其產物一步純化［J］.生物化學與生物物理學報，1996，28(4):523-530.