miR-214在腎上腺皮質腫瘤組織中的表達及意義

楊明妍，羅佐杰，鄺曉聰，秦映芬，梁杏歡，冼 晶

(1廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021;2廣西醫科大學病理生理教研室)

微小RNA(miRNA)是一種長約22 nt的非編碼小分子RNA，主要通過降解靶mRNA或抑制mRNA翻譯而調節相關蛋白表達［1］，其調節方式在許多生理、病理過程中起重要作用。近年研究表明，miRNA可能參與人類癌癥的發生，有的miRNA可能有原癌基因或抑癌基因的作用，miR-214即為其中的一種［2～6］。miR-214是新近發現的miRNA，目前，關于miR-214對腎上腺皮質癌調控機制的研究少見報道。為探討miR-214在腎上腺皮質腫瘤發生、發展中的作用，我們觀察了miR-214在腎上腺皮質腺瘤組織、瘤旁正常組織、人腎上腺皮質癌SW-13細胞系(SW-13細胞系)和裸鼠皮下移植瘤組織中的表達情況。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年12月～2011年6月在廣西醫科大學第一附屬醫院施行腎上腺皮質腫瘤手術患者21例，男8例、女13例，年齡23～56 (40.7±10.4)歲。選取其術后腎上腺皮質切除組織，離體后迅速置于液氮中冷凍，－80℃保存。其中腎上腺皮質癌組織5份、腎上腺皮質腺瘤組織8份、腎上腺皮質腺瘤瘤旁正常組織(瘤旁正常組織) 8份，均經病理檢查證實。另選本課題組前期研究保存的SW-13細胞系裸鼠皮下移植瘤組織6份，其造模和取材方法見文獻［7］。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人腎上腺皮質癌SW-13細胞系購自上海中國科學院細胞庫，采用含10%胎牛血清的DMEM/F12以1∶1比例作為培養基，將人腎上腺皮質癌SW-13細胞放置在37℃、5%CO2條件下培養。細胞生長至80%融合時，用2.5%胰酶消化并進行傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 miRNA提取 采用天根生化科技公司產miRcute miRNA提取分離試劑盒提取總miRNA;最終獲得的miRNA溶于無RNase水，－80℃保存。用紫外分光光度計檢測樣品純度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定樣品完整性。

1.2.3 RT-PCR檢測 采用天根生化科技公司產miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒對總miRNA進行逆轉錄，將最終獲得的cDNA置入－20℃保存，并以此為模板進行 PCR擴增。根據 Gene Bank的基因序列設計miR-214引物，進行RT-PCR檢測。應用Primer 5.0軟件，并取U6作為內參。目的基因miR-214上游引物為5'-TGCGGACAGCAGGCACAGAC-3'，下游引物為5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3';內參 U6上游引物為5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3'，下游引物為5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。上述引物均由上海生工合成，－20℃保存。PCR反應條件:94℃預變性4 min，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，共40個循環。實驗重復3次，結果用ABI7500統計軟件進行分析。將PCR擴增產物回收、純化后進行測序及鑒定。RT-PCR結果以 Ct值表示，采用2－△△Ct法比較miR-214的表達差異，以瘤旁正常組織為對照，U6為內參，計算待測樣品的△△Ct值，△△Ct=(待測組目的基因平均Ct值－待測組內參基因平均Ct值)－(對照組目的基因平均Ct值－對照組內參基因平均Ct值)。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，實驗結果用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 總miRNA樣品的鑒定 提取各組織標本總miRNA，經紫外分光光度計檢測顯示，其 OD260/ OD280值為1.8～2.1，說明樣品純度高、無污染;經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，各組織標本總miRNA有3條清晰的RNA帶，分別為28、18、5 s，說明樣品無降解、質量好。

2.2 PCR產物的特異性 熒光定量PCR熔解曲線顯示，PCR反應為單一峰，無非特異性熒光，提示PCR擴增產物特異性好。測序結果顯示，目的基因擴增產物為miR-214片段。本實驗中miRNA-214起始模板擴增循環數為23.18±2.18，說明PCR檢測靈敏度高;PCR擴增曲線顯示，各反應已經到達平臺期，提示PCR擴增效率好。

2.3 miR-214表達 2-△△Ct法分析顯示，miR-214在瘤旁正常組織、腎上腺皮質腺瘤組織、腎上腺皮質癌組織、SW-13細胞系、裸鼠皮下移植瘤組織中的表達分別為4.993±0.673、5.118±0.723、6.313± 0.446、6.432±0.320、7.931±0.742。miR-214在腎上腺皮質腺瘤組織、腎上腺皮質癌組織、SW-13細胞系、裸鼠皮下移植瘤組織中的表達水平分別是瘤旁正常組織的0.917、0.400、0.369、0.131倍。與腎上腺皮質腺瘤組織和瘤旁正常組織比較，腎上腺皮質癌組織、SW-13細胞系、裸鼠皮下移植瘤組織中的miR-214表達明顯降低(P均＜0.01);與腎上腺皮質癌組織和SW-13細胞系比較，裸鼠皮下移植瘤組織中的miR-214表達降低(P＜0.05)。

3 討論

miRNA是一種能調控蛋白質編碼基因的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，其在細胞核內轉錄成前體轉錄本，由RnaseⅢ核酸酶Drosha加工成發夾狀pre-miRNA轉運到細胞質，由RnaseⅢ核酸酶Dicer加工為成熟的miRNA，通過與靶基因的3'非翻譯區互補配對，在轉錄后水平調節靶基因表達;主要參與調控細胞生長、干細胞分化和腫瘤發生與發展等重要的生物學過程［1，8］。

miR-214是新發現的miRNA，可通過不同的靶基因、蛋白和通道發揮作用，調節細胞生長、分化、耐藥和血管生成;在不同腫瘤的生長過程中，其既可能作為癌基因存在，又可能作為抑癌基因發揮作用［3～6］。Yang等［3，4］研究表明，miR-214能靶向抑制人類卵巢癌的抑癌基因PTEN表達，啟動PI3K/ Akt通道，導致癌細胞凋亡減少，使其對順鉑的耐藥性增加;認為miR-214起癌基因的作用。Peter等［5］研究表明，增加T細胞中的miR-214表達，可通過其對PTEN的靶向作用提高T細胞的增殖率。Yang等［6］研究發現，與正常宮頸組織比較，miR-214在宮頸癌組織中的表達下調;并發現在人宮頸癌HELA細胞中對miR-214進行過表達處理后，其細胞增殖率明顯降低，與miR-214對人卵巢癌細胞和T細胞增殖、凋亡的調控作用恰恰相反［3～5］。因此，Yang等［6］推測miR-214在宮頸癌的發生、發展中起抑癌基因的作用，并用基因芯片篩選出MEK3和JNK1為其靶基因。

腎上腺皮質癌是一種發病率低、惡性程度高的內分泌腫瘤，該病的臨床癥狀和病理變化缺乏特異性，其與良性腎上腺皮質腫瘤的主要區別是可轉移、復發。因此，尋找調控腎上腺皮質癌惡性行為的相關基因是目前研究的重點。本研究顯示，與腎上腺皮質腺瘤組織、瘤旁正常組織比較，腎上腺皮質癌組織、SW-13細胞系、裸鼠皮下移植瘤組織中的miR-214表達明顯降低;提示miR-214表達下調可能參與腎上腺皮質癌的發生、發展。

許多研究證實，腫瘤微環境可影響腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移［9，10］。因臨床難以獲得大量的腎上腺皮質癌標本，故為其研究帶來一定困難。裸鼠皮下移植瘤模型是一種經典、實用的動物模型，本研究顯示，與腎上腺皮質癌組織和SW-13細胞系比較，裸鼠皮下移植瘤組織中的miR-214表達降低，其表達差異可能與裸鼠皮下微環境有關。

綜上所述，miR-214表達下調可能參與腎上腺皮質癌的發生、發展。但對miR-214有無調控腎上腺皮質癌細胞的增殖、凋亡等生物學特性，miR-214在腎上腺皮質癌生長過程中充當癌基因還是抑癌基因的作用及其機制，尚有待于進一步研究。

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