漸進性咬合紊亂對大鼠髁突軟骨中護骨素及核因子-？資B受體活化因子配體表達的影響

[摘要] 目的 探討漸進性咬合紊亂對大鼠髁突軟骨中護骨素（OPG）及核因子-?資B受體活化因子配體（RANKL）表達的影響。方法 選取48只8周齡大鼠，雌雄各半，隨機分為實驗組和對照組。推右側下頜、左側上頜第一磨牙近中移動，4周后同樣方式推右側下頜、左側上頜第三磨牙遠中移動，建立漸進性咬合紊亂動物模型。實驗2、4、6、8周后，每組、每性別各處死3只動物。免疫組織化學方法、陽性細胞面積百分比法分析髁突軟骨中OPG、RANKL的表達特點。結果 OPG和RANKL均表達于髁突軟骨的肥大層，實驗組OPG總體較對照組表達顯著增多（P<0.05）；實驗2、6、8周組RANKL較對照組表達明顯增多（P<0.05），實驗4周組與對照組差異無統計學意義，雌雄性變化趨

勢相同。結論 OPG和RANKL均參與了異常咬合所導致的髁突軟骨病理性改建活動。

[關鍵詞] 關節軟骨； 咬合； 護骨素； 顳下頜關節； 骨關節病

[中圖分類號] R 782.6 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.02.003

Effect of gradually induced disordered occlusion on the expression of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor-кB ligand in mandibular condylar cartilage of rats Liu Lei1， Xiong Lifeng2， Sun Lei1， He Jian-jun1， Wang Meiqing1. （1. Dept. of Oral Anatomy and Physiology， School of Stomatology， The Fourth Military Medical University， Xi’an 710032， China; 2. Dept. of Stomatology， The 477 Hospital of PLA， Xiangfan 441021， China）

[Abstract] Objective To investigate the effect of gradually induced disordered occlusion（GIDO） on the expression

of osteoprotegerin（OPG） and receptor activator of nuclear factor-кB ligand（RANKL） in mandibular condylar cartilage of rats. Methods Totally 48 rats， aged 8 weeks were included， and were divided into experimental and control groups randomly at 4 time points， with same gender distribution（n=3）. By inserting elastic rubber band the right side mandi-

bular first molar and the left side maxillary first molar were moved mesially. Four weeks later， the right side mandi-bular third molar and the left side maxillary third molar were moved distally with same method. In this way， the GIDO was established in rats. The rats were sacrificed at the end of 2th， 4th， 6th and 8th week respectively after the appli-cation of the GIDO. The expression of OPG and RANKL in condylar cartilage was examined with immunohistochemical method and calculated by the area of positive cell percentage. Results OPG and RANKL expressed predominantly in condylar cartilage hypertrophic layer. The rats in experimental group expressed a higher OPG level in all of the 4 time points than their age-matched controls（P<0.05）， while RANKL were higher in 2， 6， 8 weeks subgroups（P<0.05），

but not in 4 weeks subgroup. No differences were found between male and female subgroups. Conclusion The present results suggest that both OPG and RANKL take part in the condylar cartilage remodeling procedure in the present rat model.

[Key words] condylar cartilage； occlusion； osteoprotegerin； temporomandibular joint； osteoarthritis

顳下頜關節紊亂病（temporomandibular disorders，TMD）是顳下頜關節（temporomandibular joint，TMJ）的一種常見病、多發病，關節軟骨退行性變是其主要病理變化之一。護骨素（osteoprotegerin，OPG）及核因

子-кB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-кB ligand，RANKL）是關節疾病發病過程中的關鍵調節因子[1]。OPG屬腫瘤壞死因子受體（tumor ne-crosis factor receptor，TNFR）超家族成員，是一種分泌型的糖蛋白，主要由成骨細胞及軟骨細胞分泌[2]。Lacey等[3]發現RANKL與OPG配體（osteoprotegerin li-gand，OPGL）是同一種分子，主要由成骨細胞和骨

髓基質細胞分泌。大鼠漸進性咬合紊亂為本課題組設

計的異常咬合，前期研究表明：漸進性咬合紊亂可以導致大鼠髁突軟骨出現明顯的退行性改變[4-5]。本實驗以該漸進性咬合紊亂的大鼠模型為研究對象，觀察漸進性咬合紊亂對大鼠髁突軟骨中是否有OPG及RANKL的表達，分析其在本課題組獨創的漸進性咬合紊亂大鼠髁突退行性變中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物的選擇和分組

選取由第四軍醫大學動物實驗中心提供的8周齡雌性Sprague-Dawley大鼠48只，雌性體重180～200 g，雄性體重200～220 g，雌雄各半。隨機、等量分為實驗組和對照組。適應性飼養1周后，建立大鼠漸進性咬合紊亂模型，并在實施漸進性咬合紊亂實驗操作后2、4、6、8周每組、每性別各處死3只動物，取材。

1.2 漸進性咬合紊亂模型的建立

使用速眠新Ⅱ（0.3～0.8 mL·kg-1）（長春農牧大學獸醫研究所）腹腔注射麻醉大鼠。根據本課題組先期

發表文獻中的方法[4]并加以改進。將一段正畸皮圈插

入大鼠右側下頜及左側上頜的第一磨牙（M1）與第二磨牙（M2）之間，以推第一磨牙向近中移動，從而造成該牙尖窩不吻合的漸進性咬合紊亂。每周檢查1次，確保皮圈不脫落。1周后雙側第一磨牙達到最大前移距離0.8 mm，將橡皮圈取出，換以聚甲基丙烯酸甲酯（自凝塑料）保持間隙，并使其低于牙齒咬合面。實驗開始4周后在右側下頜及左側上頜第二磨牙與第三磨牙之間同樣方法置皮圈推第三磨牙向遠中移動。對照組同環境飼養，不作任何實驗處理。

1.3 標本制備

在實驗開始2、4、6、8周后，乙醚吸入深度麻醉下經主動脈插管灌注0.1 mol·L-1的PBS緩沖液（每

只200 mL）和40 g·L-1多聚甲醛（每只400 mL），取出雙側TMJ，40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h，Kristense液中脫鈣1周，常規脫水，石蠟包埋，切片厚約5 μm。

1.4 免疫組化SABC染色和定量分析方法

1.4.1 免疫組化SABC染色方法 選取大鼠TMJ中部切片，常規脫蠟至水，3%過氧化氫液作用10 min，復合消化液（武漢博士德生物工程有限公司）作用10 min，OPG和RANKL單克隆抗體1∶50（北京博奧森生物技術有限公司）4 ℃孵育過夜，次日復溫后經生物素二抗工作液（北京中杉金橋生物技術有限公司）37 ℃孵育30 min、生物素37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精輕度襯染，脫水，封片。

1.4.2 定量分析方法 采用Leika DM 2500顯微鏡采集顯微影像，在photoshop 8.0環境下選取TMJ髁突軟

骨對應于關節盤前、中、后帶處肥大層的3個800 px×300 px的測量框，Leika Q Win軟件測量所選測量框中陽性細胞面積與測量框面積的百分比（簡稱陽性細

胞面積百分比）[6]，取平均值作統計分析。

1.5 統計學方法

采用SPSS 11.0統計軟件中單因素方差分析方法比較各組所測得的陽性細胞面積百分比，對于有顯著差異的組別應用SNK-q檢驗方法實行組內兩兩時間點間的比較，α<0.05為有統計學意義。

2 結果

實驗組髁突軟骨出現不同程度的退行性改變，表現為髁突軟骨局部變性壞死，其附近軟骨分層模糊，細胞排列紊亂，軟骨增厚。

2.1 髁突軟骨OPG和RANKL的免疫組化染色結果

OPG主要表達于髁突軟骨肥大層軟骨細胞胞漿內，呈棕黃色（圖1A），大鼠脛骨組織陽性對照非常典型，可見骨細胞呈棕黃色染色（圖1B）；PBS替代一抗作為替代對照，髁突軟骨細胞未見陽性染色。

RANKL集中表達于髁突軟骨肥大層（圖2A），髁突軟骨細胞胞漿呈棕黃色；大鼠脛骨組織陽性對照非常典型，可見骨細胞呈棕黃色染色（圖2B）；PBS替代一抗作為替代對照，髁突軟骨細胞未見陽性染色。

2.2 定量分析結果

2.2.1 OPG的定量分析結果 在雌性對照組中，隨著年齡的增長，OPG的表達總體上呈現逐漸降低的趨勢（P<0.05），雖然實驗4周組較實驗2周組（P=0.408）

以及實驗8周組較實驗6周組（P=0.781）的表達差異均無統計學意義，但實驗6、8周組的陽性細胞表達較實驗2周組均顯著降低（P<0.05，圖3）。在雌性實驗

組中，OPG陽性細胞較密集，實驗2、4、6、8周組陽性細胞面積百分比與同齡對照組相比均呈現出增多的趨勢（P<0.05），且以實驗6周組增多最為顯著（P=0.001）。實驗6周組的表達強于4、8周組（P<0.05），

但與2周組間差異無統計學意義（P＝0.57，圖3）。

在雄性對照組中，隨著年齡的增長，OPG的表達總體上也呈現逐漸降低的趨勢（P<0.05），實驗4、6、8周組的陽性細胞表達較實驗2周組均顯著降低（P=

0.031），但實驗4、6、8周組間表達差異無統計學意義（P>0.05，圖4）。在雄性實驗組中，實驗2、4、6

周組OPG陽性細胞面積百分比與同齡對照組相比均顯著增強（P<0.05），而實驗8周組較同齡對照組差異不明顯（P＝0.472）。實驗2、4、6周組表達未見明顯

變化（P>0.05），實驗8周組較實驗6周組有明顯降低

（P＝0.005，圖4）。

2.2.2 RANKL的定量分析結果 雄、雌性大鼠對照組RANKL表達趨勢相同（圖5、6）。隨著年齡增長，

RANKL在對照組的陽性細胞面積百分比有一定上升趨勢（P<0.05），實驗8周組較實驗2、6周組顯著增高（P<0.05）。雄性和雌性實驗組均表現出以下規律：在實驗2、6、8周RANKL表達較同齡對照組陽性表達面積均增大（P<0.05），但實驗4周組與其同齡對照組差異無統計學意義（雄性P=0.201，雌性P=0.467）。雌性實驗6、8周組陽性細胞表達較4周組強（P<0.05，圖5），實驗2、4周組間差異不顯著（P＝0.342）。雄性實驗2、6、8周組表達明顯強于4周組（P<0.05，圖6）。

3 討論

成骨細胞和破骨細胞的共同作用，維持著骨形成和骨吸收之間的平衡，該作用受到細胞因子的調節[7]。OPG/RANKL/RANK系統是參與破骨細胞分化過程的一條最重要的信號通路，在骨和軟骨代謝中發揮著重要作用[8]。RANKL可以促進腫瘤壞死因子-α

（tumor necrosis factor-α，TNF-α）介導的破骨細胞生成作用，促進骨吸收；OPG則可競爭性的與RANKL結合，抑制RANK的破骨活動[9]。本實驗結果顯示：

OPG在對照組表達總體呈現出隨年齡增長逐漸降低的趨勢，與Makhluf等[10]對各年齡層人骨髓細胞表達OPG情況的研究結果相一致。RANKL在對照組中的表達隨年齡增長而逐漸增高，與髁突軟骨厚度隨年齡增長而逐漸變薄的趨勢相吻合。

軟骨的合成和分解代謝在各種細胞因子的作用下處于一個動態平衡中。研究表明TNF-α、白細胞介素-1等許多細胞因子能使RANKL的表達增多[11-12]。本課題組前期研究證明，漸進性咬合紊亂可以使下頜髁突軟骨發生退行性改變[4，13-15]，并可導致髁突軟骨內炎性細胞因子TNF-α的表達明顯增高[6]。本研究結

果顯示：RANKL與本課題組前期研究報道的TNF-α的表達趨勢[6]一致，實驗2周時較相應對照組顯著增高，說明第一次分牙的刺激即可引起髁突軟骨分泌活動異常，但隨著時間的推移，組織對該異常咬合刺激有所適應，因此實驗4周組RANKL的表達回落。然而二次分牙的刺激，使得髁突軟骨中RANKL的表達又一次明顯增強。這種增強的效果之一便是軟骨下骨出現明顯的丟失[16]。

應用OPG抑制RANKL的生物活性在關節疾病治療中有重要意義。將OPG注入骨質疏松小鼠體內后4周，可觀察到破骨細胞的數量明顯減少，骨量較對照組顯著增多[17]。類風濕病患者關節滑液中分離的

炎癥細胞均可表達RANKL，但不表達OPG，因此應用OPG治療不但可增加骨量，而且能保護軟骨關節面免受侵蝕[18]。在佐劑性關節炎動物模型中[2]，炎癥部位可檢測到RANKL的表達，給予OPG后則可以顯著抑制骨關節的破壞。本實驗結果實驗組OPG總體表達較同齡對照組顯著增強（雖然雄性大鼠實驗8周組差異不明顯），且均以二次分牙后的首次檢測時間點——實驗6周組表達最強，說明漸進性咬合紊亂在啟動軟骨細胞分泌RANKL活動增強的同時，伴隨著OPG分泌活動的增強，對軟骨下骨丟失起一定的保護作用，體現了骨關節炎合成代謝與分解代謝活動伴隨存在[19]的病理特征。

OPG和RANKL在異常咬合所導致的骨關節病樣變髁突軟骨中均有高表達，提示本研究大鼠模型髁突軟骨病變中包含著分解代謝與合成代謝相伴存在的典型骨關節病樣變化。

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（本文編輯 杜冰）