白色假絲酵母菌pACT1-GFP質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)

[摘要] 目的 構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的白色假絲酵母菌菌株，以便對目的基因進(jìn)行示蹤。方法 構(gòu)建pACT1-GFP質(zhì)粒，以白色假絲酵母菌CAI4菌株作為感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后，分別觀察綠色熒光蛋白在兩相型下的表達(dá)情況。結(jié)果 含有pACT1-GFP的白色假絲酵母菌菌株，99%在兩相型下均有較高水平的熒光蛋白表達(dá)，且熒光強(qiáng)度沒有明顯差別。結(jié)論 pACT1-GFP能夠在白色假絲酵母菌體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 白色假絲酵母菌； 綠色熒光蛋白； 質(zhì)粒

[中圖分類號] R 780.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.02.002

The construction and expression of Saccharomyces albicans pACT1-GFP plasmids Sun Jing， Jia Fen， Xia Ming-hui， Qian Hua， Dong Hongnan， Qi Qingguo. （School of Stomatology of Shandong University， Key Laboratory of Oral Biomedicine of Shandong Province， Jinan 250012， China）

[Abstract] Objective To construct strains containing green fluorescent protein（GFP） to study gene regulation in

Saccharomyces albicans cells during the infection process. Methods pACT1-GFP was constructed， and Saccharomyces albicans CAI4 was transformed. The expression of GFP in yeast and hyphal compartments was observed with micros-copy. Results 99% of Saccharomyces albicans cells containing pACT1-GFP fusion displayed significant fluorescence levels both in the yeast and hyphal compartments. The fluorescence intensity in two compartments had no obvious dif-ference. Conclusion pACT1-GFP can be expressed stably in the yeast cells.

[Key words] Saccharomyces albicans； green fluorescent protein； plasmid

白色假絲酵母菌（Saccharomyces albicans）是口腔正常微生物群的組分之一，也是口腔中重要的條件致病真菌[1]，在特定條件下能夠引起體表以及深部組

織器官的感染，特別是免疫缺陷患者，可引發(fā)致命性的真菌感染。白色假絲酵母菌的致病性主要與細(xì)胞外酶、分泌型天冬氨酸蛋白酶、黏附因子、兩相型態(tài)、毒素、細(xì)胞表面成分等毒力因子有關(guān)，這些因素在白色假絲酵母菌的定植、感染及疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮相應(yīng)的作用，但各毒力因素何時發(fā)揮作用及其具體的生理功能尚未完全確定。本實驗的目的是構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent pro-tein，GFP）的白色假絲酵母菌株，以便對目的基因進(jìn)行示蹤，觀察其在白色假絲酵母菌感染過程中個體菌細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)情況，為研究毒力因子在菌株定植、感染及疾病發(fā)展過程中的基因表達(dá)調(diào)控特征及生理功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

硫酸鹽腺嘌呤（adenine hemisulfate）、5-氟乳清酸（5-fluororotic acid，5-FOA）、酵母合成培養(yǎng)基補(bǔ)料（Yeast synthetic drop-out medium）、乙酸鋰LiAC·

2H2O、聚乙二醇PEG3350、鮭精DNASalmon sperm DNA（Sigma公司，美國），限制性內(nèi)切酶SalⅠ、MluⅠ、Hind Ⅲ、NheⅠ、PstⅠ、StuⅠ及T4 DNA Ligase（Fer-mentas公司，加拿大）。

1.2 菌株及培養(yǎng)條件

白色假絲酵母菌CAI4（ura3::λimm434/ura3::λi-

mm434）由美國東北大學(xué)抗生素研究中心Kim Lewis教授惠贈，用完全合成培養(yǎng)基（synthetic complete，SC）培養(yǎng)，并用尿嘧啶缺陷SC（SC-Ura）培養(yǎng)基或含有5-FOA的SC培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行基因型核對，以白色假絲酵母菌3153a模式株作為對照。酵母相菌株用普通YPD培養(yǎng)基在30 ℃下培養(yǎng)48 h，然后用10%胎牛血清在

37 ℃下培養(yǎng)誘導(dǎo)芽管形成進(jìn)入菌絲相[2]。

1.3 pACT1-GFP質(zhì)粒的構(gòu)建

所有質(zhì)粒的構(gòu)建均是基于白色假絲酵母菌轉(zhuǎn)化載體CIp10[3]進(jìn)行的。

1.3.1 構(gòu)建pCYC1t 將含有白色假絲酵母菌CYC1終止子[4]寡核酸鏈（正義鏈：5’-TCGAGAAGCTTGCA-TGCCTGCAGGCTAGCGTCCCTATTTATTTTTTT-ATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTA-TATTTCAAATT，其中CYC1終止子序列用粗體表示，限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、PstⅠ和NheⅠ酶切位點

用斜體表示）退火后用T4 DNA連接酶連接到經(jīng)限制性內(nèi)切酶SalⅠ和MluⅠ雙酶切的CIp10載體上，構(gòu)建

pCYC1t。然后將酵母增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因序列yEGFP[5]插入到pCYC1t上的限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和

PstⅠ酶切位點之間。

1.3.2 構(gòu)建pACT1-GFP 使用針對白色假絲酵母菌ACT1基因啟動子序列設(shè)計的一對引物[6]，5’-ATCG-CTCGAGCTATTAAGATCACCAGCCTC和5’-CATAC-CACCAAGCTTTTTGAATGATTATATTTT（限制性內(nèi)切酶Xho Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點用斜體表示），通過聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增白色假絲酵母菌ACT1基因啟動子序列，然后將其連接到經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xho Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切的pCYC1t上，構(gòu)建pACT1-GFP質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌后經(jīng)氨芐抗性及酶切初步鑒定，確定轉(zhuǎn)化成功后，對插入片段進(jìn)行基因測序分析以確定質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.4 白色假絲酵母菌轉(zhuǎn)化

pACT1-GFP質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶StuⅠ酶切線

性化后根據(jù)醋酸鋰介導(dǎo)的酵母菌轉(zhuǎn)化方法（LiAc/SS

carrier DNA/PEG方法）轉(zhuǎn)化白色假絲酵母菌CAI4

（ura3::λimm434/ura3::λimm434）菌株[7]，轉(zhuǎn)化體系如下：240 μL聚乙二醇3350，36 μL 1 mol·L-1 LiAC，

50 μL 2 g·L-1單鏈鮭精DNA，0.5～1.0 μg質(zhì)粒DNA，加無菌去離子水補(bǔ)足360 μL，同時設(shè)陰性對照組（不加

入質(zhì)粒）。最后用尿嘧啶缺陷SC培養(yǎng)基進(jìn)行篩選確定轉(zhuǎn)化成功。轉(zhuǎn)化成功后，通過檢測菌液不同時點在600 nm處的光密度（optical density，OD）值，來觀察質(zhì)粒pACT1-GFP對菌體生物性狀的影響。

1.5 顯微鏡觀察

取適量不同生長階段酵母相和菌絲相的白色假絲酵母菌菌株涂片，在熒光顯微鏡下觀察，選用488 nm波長的激光器激發(fā)綠色熒光，在適宜的掃描分辨率下進(jìn)行計算機(jī)數(shù)據(jù)采集數(shù)字成像，檢測熒光強(qiáng)度，觀

察綠色熒光蛋白在兩相型下的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

白色假絲酵母菌CAI4在SC、含5-FOA的SC培養(yǎng)基上生長良好，在SC-Ura培養(yǎng)基上無法生長（圖1）；而白色假絲酵母菌3153a模式株在SC、SC-Ura培養(yǎng)基上生長良好，在含5-FOA的SC培養(yǎng)基上無法生長。這表明白色假絲酵母菌CAI4缺少活性URA3基因，這是因為具有活性URA3基因的白色假絲酵母菌可將5-FOA轉(zhuǎn)化為有細(xì)胞毒性的氟脫氧尿苷，當(dāng)培養(yǎng)基中有尿嘧啶時，只有URA3基因突變的白色假絲酵母菌才能在含有5-FOA的SC培養(yǎng)基上生長。

含pACT1-GFP質(zhì)粒的白色假絲酵母菌在SC、SC-Ura培養(yǎng)基上生長良好，在含5-FOA的SC培養(yǎng)基上無法生長（圖1）；不含質(zhì)粒的陰性對照組在SC、含5-

FOA的SC培養(yǎng)基上生長良好，在SC-Ura培養(yǎng)基上無

法生長。這表明白色假絲酵母菌轉(zhuǎn)化成功。在SC培養(yǎng)基上生長的、含有pACT1-GFP的白色假絲酵母菌中，99%的菌株均有較高水平的綠色熒光蛋白表達(dá)，而且在延滯期、對數(shù)期、對數(shù)后期、穩(wěn)定期，綠色熒光蛋白的表達(dá)水平相對穩(wěn)定，各時間點間無明顯差別（圖2）。在用10%胎牛血清37 ℃誘導(dǎo)芽管形成進(jìn)入菌絲相時，菌株仍有較高水平的綠色熒光蛋白表達(dá)，且兩相型下綠色熒光蛋白的表達(dá)強(qiáng)度無明顯差別（圖3）。

3 討論

本研究的目的是利用酵母型綠色熒光蛋白基因穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化整合載體質(zhì)粒CIp10，在不影響菌株其他生物特性的情況下，構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的菌株，以便對目的基因進(jìn)行示蹤，觀察其在白色假絲酵母菌感染過程中個體菌細(xì)胞基因表達(dá)情況，為研究毒力因子在菌株定植、感染及疾病發(fā)展過程中的基因表達(dá)調(diào)控特征及生理功能奠定基礎(chǔ)。

酵母菌整合載體CIp10自身帶有篩選標(biāo)記CaURA3

及多個克隆位點，但缺乏白色假絲酵母菌復(fù)制起點；其包含的核糖體蛋白10（RP10）編碼區(qū)[8]與目標(biāo)染色

體具有高度同源性，為重組染色體提供了良好的整合位點。使用該區(qū)域作為整合位點同時還具有以下優(yōu)勢：1）酵母菌染色體含有2個RP10同源基因，其中一個發(fā)生變異后并不會影響菌株在各類培養(yǎng)基（營養(yǎng)

豐富的培養(yǎng)基或基本培養(yǎng)基）上的生長狀況；2）RP10

表達(dá)水平較高，在此區(qū)域插入重組基因，可以保證其高效表達(dá)，避免假陰性結(jié)果。此外在RP10編碼區(qū)內(nèi)含有2個特異性酶切位點（限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、StuⅠ），

在線性化DNA時可供選擇。

堿金屬陽離子介導(dǎo)釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化的方法最初是由Ito等[9]在1983年提出的，在此后幾十年里，該方法被不斷地完善以提高轉(zhuǎn)化效率和縮短轉(zhuǎn)化所需的時間，最終形成了LiAc/SS carrier DNA/PEG方法。其最主要的改進(jìn)是引入了單鏈DNA作為載體[10]，并對

單鏈DNA載體、質(zhì)粒DNA濃度及感受態(tài)細(xì)胞數(shù)目均作了優(yōu)化處理，極大地提高了酵母菌的轉(zhuǎn)化效率，能夠快速高效地實現(xiàn)酵母菌轉(zhuǎn)化，且十分靈活，通過修飾可用于多種不同目的的酵母分子生物學(xué)研究，此外該方法可以轉(zhuǎn)化寡核苷酸鏈及在基因敲除實驗中通過轉(zhuǎn)化線性DNA結(jié)構(gòu)以成功敲除目的基因[11-12]。

本研究中通過在CIp10載體內(nèi)插入酵母增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因序列yEGFP，并在其上游插入CYC1基因終止子，同時選用在酵母基因表達(dá)研究中常使用的酵母ACT1基因的啟動子[13]，構(gòu)建質(zhì)粒pACT1-

GFP，轉(zhuǎn)化白色假絲酵母菌CAI4菌株后，檢測菌液不同時點在600 nm處的光密度值，來觀察質(zhì)粒pACT1-GFP對菌體生物性狀的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白色假絲酵母菌CAI4的生物特性在轉(zhuǎn)化前后無明顯變化，表明綠色熒光蛋白基因的引入并不會改變菌細(xì)胞的生物學(xué)性狀；通過對個體菌細(xì)胞表達(dá)的熒光蛋白強(qiáng)度進(jìn)行檢測，觀察該重組基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示99%的含pACT1-GFP的白色假絲酵母菌細(xì)胞均有較高水平的熒光表達(dá)，且在延滯期、對數(shù)期、對數(shù)后期、穩(wěn)定期，熒光蛋白的強(qiáng)度相對穩(wěn)定，沒有明顯改變；在誘導(dǎo)進(jìn)入菌絲相時，亦有較高水平的熒光表達(dá)，且兩相型下綠色熒光強(qiáng)度沒有明顯差別。pACT1-GFP在白色假絲酵母菌菌細(xì)胞整個生命過程中穩(wěn)定表達(dá)，

提示該方法可能同樣適用于在感染組織中對白色假絲酵母菌個體綠色熒光蛋白表達(dá)的定量分析。此外，約有1%的含pACT1-GFP的白色假絲酵母菌菌細(xì)胞表達(dá)的綠色熒光強(qiáng)度很低或無熒光蛋白表達(dá)，提示這一部分有別于其他菌細(xì)胞的菌株可能是近年提出的滯留菌，即處于特殊狀態(tài)時（比如休眠狀態(tài)）的特殊表現(xiàn)型，但尚需驗證。

GFP作為報告基因技術(shù)在研究菌株基因表達(dá)特征方面具有重要意義，基于該報告基因系統(tǒng)，亦可以通過將GFP與目的基因融合研究白色假絲酵母菌個體在體內(nèi)外基因表達(dá)情況，觀察其目的基因在菌株定植、感染及疾病發(fā)展過程中的表達(dá)調(diào)控特征及生理功能。

致謝：感謝美國東北大學(xué)抗生素研究中心Kim Lewis教授提供CAI4菌株。

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（本文編輯 李彩）