大鼠咬合創傷早期牙槽骨基因差異表達的初步探討

[摘要] 目的 探討咬合創傷早期牙槽骨吸收基因表達差異及相關信號通路。方法 通過在大鼠左側上頜第一磨牙粘接鋼絲建立同側下頜咬合創傷實驗動物模型，24 h后局部麻醉下分離大鼠雙側下頜牙槽骨組織，提取總RNA進行包括27 000個基因的全功能組表達譜基因芯片檢測，對差異表達基因進行Pathway和GO分析，并采用實時定量聚合酶鏈反應對芯片結果進行驗證。結果 芯片結果顯示，差異基因共有586個，其中表達增強166個，表達降低420個，Pathway分析涉及106個不同的信號通路，GO分析主要涉及270個不同的功能分類。結論 咬合創傷24 h牙槽骨已開始出現骨平衡變化，該期主要表現為成骨細胞和成骨活動抑制，破骨細胞發生及破骨現象增強尚未顯現。

[關鍵詞] 咬合創傷； 骨吸收； 基因芯片； 成骨細胞； 破骨細胞

[中圖分類號] Q 786 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.02.018

The primary study on the gene expression profiles of alveolar bone with traumatic occlusion in early stage in rats Wan Haoyuan1， Sun Huiqiang1，2， Shang Sixia1， Li Xin1. （1. Stomatological Hospital of Shandong University， Jinan 250012， China; 2. Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Biomedicine， Jinan 250012， China）

[Abstract] Objective To study the gene expression profiles of traumatic occlusion in early stage with the animal model of rats. Methods The occlusal surface of the upper left first molar of rat was raised by placing a stainless steel wire to induce occlusal trauma in the lower left first molar. After 24 hours， the alveolar bone tissue of the first molars at the both sides of rats’ lower jaws were taken out under anesthesia. The different expressive genes were shown by genome-wide microarray， which comprises about 27 000 genes and analyzed the different expressive genes with Path-way and GO analysis， finally the results of the microarray were examined by real time-polymerase chain reaction（RT-

PCR）. Results In the results of the study， 586 different expressions were found， of which the expressions of 166 genes increased and 420 genes decreased. 106 different pathways were involved with Pathway analysis and 270 different functional classification related to GO analysis. Conclusion The balance of the lower alveolar bone is destroyed after 24 hours of traumatic occlusion. At early phase of the occlusal trauma， osteogenesis and bone formation in alveolar bone are inhibited， yet osteoblast genesis and bone resorption are not significant.

[Key words] traumatic occlusion； bone resorption； genome-wide microarray； osteoblast； osteoclast

咬合創傷[1]通過龐大的信號因子群及復雜的信

號網絡產生作用。研究信號因子在咬合創傷早期表達差異的情況對于發現其導致骨吸收的“源信號”有重要意義。本實驗采用基因芯片技術對咬合創傷早期大鼠病變側和對側牙槽骨組織進行表達譜分析，旨在檢測咬合創傷早期大鼠牙槽骨基因表達譜中的差異表達基因，通過篩選差異表達基因，進一步明確咬合創傷造成牙槽骨吸收的分子生物學機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

咬合升高粘接復合樹脂（3M公司，德國），Tri-

zol（Invitrigen公司，美國），聚合酶鏈反應（polyme-

rase chain reaction，PCR）試劑盒、DNA聚合酶和

dNTP（MBI公司，立陶宛），引物（上海生物工程有限

公司）。27 K Rat Genome Array芯片的Oligo DNA參自Oligo庫（Operon公司，美國），NucleoSpin Extract

Ⅱ Kit（Macherey-Nagel公司，德國），LuxScan 10 KA雙通道激光掃描儀（北京博奧生物有限公司）。

1.2 動物模型建立

選取由山東大學實驗動物中心提供的雄性SD大鼠5只，體重（280±20） g。腹腔內注射水合氯醛，劑量為100 mg·kg-1，麻醉狀態下在大鼠左側上頜第一磨牙咬合面上粘接厚度為1 mm的方絲，用Super-bond復合樹脂堆積法粘接，形成同側下頜第一磨牙的咬合創傷模型。左側下頜第一磨牙處牙槽骨作為實驗側，同一只大鼠對側下頜第一磨牙處牙槽骨為對照側。常規飲食，24 h后腹腔注射水合氯醛，拔除雙側第一磨牙，刮凈牙槽窩內牙周膜，取大鼠雙側牙槽骨組織放入液氮，備用。

1.3 總RNA提取

按TrizolTM NA Isolation Reagent流程提取大鼠牙槽骨中總RNA，通過異丙醇沉淀法濃縮RNA，進一步對總RNA行過柱純化，最后用分光光度計定量，甲醛變性膠電泳質檢。

1.4 探針標記和雜交

取兩側牙槽骨組織總RNA各50 μg，逆轉錄合成cDNA，將cDNA用KLENOW酶標記：Cy3-dCTP標記實驗組cDNA，Cy5-dCTP標記對照組cDNA，標記產物用PCR NucleoSpin Extract Ⅱ Kit純化，純化后抽干。

1.5 全功能組表達譜基因芯片制備和雜交

將標記的DNA溶于30 μL雜交液中，42 ℃下全功能組表達譜基因芯片雜交過夜。雜交結束后，在42 ℃含0.2％十二烷基磺酸鈉、2×SSC的液體中洗滌5 min，再在0.2×SSC中室溫洗滌5 min。最后將玻片甩干，用LuxScan 10 KA雙通道激光掃描儀掃描。

1.6 差異基因檢測和分析

利用生物信息學分析Cy3、Cy5熒光強度，計算Cy5/Cy3值。Cy5/Cy3>1.5，基因表達增高，Cy5/Cy3<0.666 7，基因表達降低；并對全功能組表達譜基因芯片包含的27 000個基因中的差異表達基因進行Path-way分析及不同功能分類的GO分析。

1.7 芯片結果的實時定量聚合酶鏈反應（real time-

polymerase chain reaction，RT-PCR）驗證

選取芯片結果中表達顯著差異的3個因子，采用RT-PCR技術觀察其表達改變情況，對芯片結果進行RT-PCR驗證。

2 結果

2.1 總RNA提取

電泳檢測RNA帶顯示：28S、18S條帶清晰（圖1），紫外分光光度計檢測A260 nm/A280 nm為1.8～2.0。表明RNA質量較好，符合實驗要求。

2.2 芯片雜交

實驗側和對照側表達差異基因共有586個，其中

表達增強166個（其中顯著表達增強48個），表達降低

420個（其中顯著表達降低59個）。Pathway分析涉及

106個不同的信號通路，主要包括p53信號通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路等（表1）。GO分析主

要涉及270個不同的功能分類，包括成骨細胞分化、骨礦化等（表2）。

1：實驗側牙槽骨；2：對照側牙槽骨；3：Marker。

2.3 RT-PCR驗證

在實驗結果中選擇有代表性的、表達顯著改變且與成骨相關的Bglap、Alp1及Wnt4因子設計引物（表3），以Actin為內參（正向引物：5’-GTACCCAGGC-ATTGCTGACA-3’，反向引物：5’-CTCCTGCTTGC-TGATCCACATC-3’）進行RT-PCR驗證，實驗結果與芯片結果一致（表3）。驗證結果見圖2。由圖2可見，RT-PCR反應特異性都很好。

3 討論

咬合創傷作為一種病理性損傷可以造成牙周組織的適應性改變，導致牙槽骨吸收[2-3]。本實驗建立了下頜第一磨牙的咬合創傷模型，建模方法對實驗動物沒有損傷，效果好[4-5]。

正常骨組織處于動態平衡狀態，機械應力可以

影響該平衡，骨組織內效應細胞感知機械應力后將信號傳遞給成骨細胞與破骨細胞，從而促進骨的改建。研究發現：當較小的應力作用于骨組織時有利于骨組織形成及骨損傷的修復，而當作用力超過一定的范圍則會導致骨吸收[6]。應力產生作用的機制可

能為：應力作用于牙槽骨時骨基質中的組織液發生流動，骨細胞感受到液壓變化，其基因表達水平及活性發生改變，并釋放一系列的細胞因子、蛋白激酶等，通過信息的傳遞和轉導最終導致骨重建。該過程涉及復雜的信號通路[7-9]，目前應力導致骨吸收的具體機制及信號通路并未完全清楚。研究發現MAPK通路不僅對成骨細胞的增殖、黏附、伸展、遷移及整合素的表達有重要意義，同時它對破骨細胞的形成、生存、分化及刺激骨吸收也有重要作用[10-12]。研

究發現Wnt信號系統在成骨細胞的發育及分化過程中發揮重要作用，它可以調節成骨細胞的分化、骨基質的形成及礦化等環節，并影響破骨細胞的發生和骨吸收等[13-14]。McLennan等[15]研究證實轉化生長因子-β一方面能夠抑制成骨細胞分化，另一方面促進基質前體細胞增殖，從而增加分化為成骨細胞的細

胞數量，還可以調節骨橋蛋白、骨粘連蛋白、骨鈣素以及Ⅰ型膠原蛋白等骨基質蛋白的代謝[16-17]。細胞

骨架在應力信號傳導過程中也發揮重要的作用，細胞骨架系統是細胞內的一種纖維狀蛋白基質，流體剪切力可以通過改變成骨細胞骨架組成誘導肌動蛋白絲重組和去重組來參與細胞運動、分裂分化、細胞內物質運輸及跨膜信息傳遞等功能[18]。當細胞受到

應力、應變作用時，借助于細胞膜上分子感受器的直接接觸，通過細胞骨架將力學信號傳到細胞的各個部位，使相應的效應分子激活、合成、分泌等功能發生變化，引發一系列的信號通路，對細胞的增殖、分裂、運動等產生影響[19]?？p隙連接是細胞間

直接進行物質交流的膜通道結構，其在骨組織中廣泛存在，縫隙連接在由力學信號轉換為生物效應的過程中起著重要的作用[20]。各信號通路內部因子之間通過復雜的反饋、負反饋以及級聯等活動彼此產生影響，此外，各通路間還存在復雜的“串話”現象，它們形成一個網絡體系對骨平衡產生影響。

本實驗結果顯示包括p53、MAPK、Wnt、鈣離子信號通路等相關的信號通路參與了咬合創傷早期牙槽骨骨吸收的生物過程，成骨細胞特定基因及骨鈣化、調節礦化基因均顯著下調，成骨作用受到顯著抑制；未發現破骨及破骨細胞相關信號基因表達顯著上調。研究結果初步表明在咬合創傷24 h時，牙槽骨骨吸收相關活動已經開始，主要表現為成骨細胞及成骨活動的抑制，破骨細胞及破骨活動尚未出現。

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（本文編輯 杜冰）