吸煙和細胞色素P450 1A1-MspⅠ、谷胱甘肽硫轉移酶T1基因多態性與口腔癌的相關性研究

[摘要] 目的 探討吸煙和細胞色素P450（CYP）1A1-MspⅠ、谷胱甘肽硫轉移酶（GST）T1基因多態性與口腔癌發病之間的關系。方法 采用病例-對照研究的方法，以300例口腔癌患者（病例組）及300例非癌對照者（對照組）的外周血白細胞為樣本，利用聚合酶鏈反應（PCR）技術檢測Ⅰ相代謝酶CYP1A1-MspⅠ和Ⅱ相代謝酶GSTT1基因多態性，并分析吸煙和2種代謝酶基因多態性與口腔癌的相關性。結果 病例組CYP1A1-MspⅠ突變純合型（m2/m2）和GSTT1基因缺陷型[GSTT1（-）]的頻率分布分別為38.33%、69.33%，而對照組的頻率分布分別為21.00%、44.33%，二者差異有統計學意義（P<0.01）。CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）者患口腔癌的風險顯著增加（OR=2.34，95%CI為1.76～4.07）。GSTT1（-）者患口腔癌的風險也顯著增加（OR=2.84，95%CI為1.98～4.54）。基因突變的協同分析發現CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）/GSTT1（-）在病例組和對照組中的分布頻率分別為30.67%和6.67%，二者差異有統計學意義（P<0.01）。CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）/GSTT1（-）者患口腔癌的風險顯著增加（OR=8.27，95%CI為3.63～11.29）。病例組的吸煙率顯著高于對照組的吸煙率（OR=2.71，95%CI為1.31～4.52，P<0.01），CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）及GSTT1（-）與吸煙有協同作用（OR=25.00，95%CI為11.87～35.64）。結論 CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）和GSTT1（-）是口腔癌的易感因素，吸煙與口腔癌的易感性也有關，CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）和GSTT1（-）與吸煙在口腔癌的發生上有相互促進的作用。

[關鍵詞] 口腔癌； 細胞色素P450 1A1-MspⅠ； 谷胱甘肽硫轉移酶T1； 多態現象； 吸煙

[中圖分類號] R 739.8 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.02.019

Correlation between smoking and the polymorphisms of cytochrome P450 1A1-MspⅠand glutathione S-trans-ferase T1 genes and oral cancer Guo Like1， Zhang Chaoxian2， Shi Shumin1， Guo Xiaofeng3. （1. Dept. of Stomato-logy， The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College， Weihui 453100， China; 2. Dept. of Gastroenterology， The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College， Weihui 453100， China; 3. Dept. of Hepatology， The Sixth People’s Hospital of Hangzhou， Hangzhou 310014， China）

[Abstract] Objective To investigate the correlation between the combination of smoking and the polymorphisms

of cytochrome P450（CYP） 1A1-MspⅠ and glutathione S-transferase（GST） T1 genes and oral cancer. Methods The genetic polymorphisms of CYP1A1-MspⅠ and GSTT1 were detected by polymerase chain reaction（PCR） technique

in peripheral blood leukocytes of 300 oral cancer cases and 300 non-cancer controls， and the correlation between smo-king， the two metabolic enzymes genetic polymorphisms and oral cancer were analyzed. Results The frequencies of CYP1A1-MspⅠ（m2/m2） and GSTT1（-） were 38.33% and 69.33% in oral cancer cases and 21.00% and 44.33% in healthy controls respectively. Statistical tests showed significant difference in the frequencies between the two groups

（P<0.01）. The risk of oral cancer with CYP1A1-MspⅠ（m2/m2） was significantly higher than that of controls（OR=

2.34， 95%CI 1.76-4.07）. The individuals who carried with GSTT1（-） had a high risk of oral cancer（OR=2.84， 95%CI 1.98-4.54）. Combined analysis of the polymorphisms showed that percentage of CYP1A1-MspⅠ（m2/m2)/GSTT1（-）

in oral cancer and control groups was 30.67% and 6.67% respectively（P<0.01）. The people who carried with CYP1A1-

MspⅠ（m2/m2）/GSTT1（-） had a high risk of oral cancer（OR=8.27， 95%CI 3.63-11.29）. The smoking rate of the case group was significantly higher than that in the control group（OR=2.71， 95%CI 1.31-4.52， P<0.01）， and statistic analy-

sis suggested an interaction between smoking and CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）/GSTT1（-） genotypes polymorphisms which

increased risk of oral cancer（OR=25.00， 95%CI 11.87-

35.64）. Conclusion CYP1A1-MspⅠ（m2/m2） and GS-

TT1（-） are the risk factors in oral cancer． Smoking is

also related to the susceptibility to oral cancer. There

may be a synergetic interaction among CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）， GSTT1（-） and smoking on the elevated susceptibility

of oral cancer.

[Key words] oral cancer； cytochrome P450 1A1-MspⅠ； glutathione S-transferase T1； polymorphism； smoking

吸煙被認為是口腔癌的重要危險因素。香煙中的多環芳烴、雜環胺和亞硝胺類物質是作用明確的化學致癌物。目前已知大多數的化學致癌物在體內都需要生物轉化激活或解毒，此過程涉及的代謝酶分為兩大類，即Ⅰ相代謝酶和Ⅱ相代謝酶。Ⅰ相代謝酶為代謝活化酶，許多前致癌物經過代謝活化成為終致癌物。Ⅱ相代謝酶為代謝解毒酶，可以把致癌物或其毒性代謝產物轉化成對人體無害的物質并排出體外。致癌物能否引起靶細胞癌變在很大程度上取決于這兩類酶的活性及彼此的平衡關系。代謝酶的基因大多具有多態性，某些基因的多態性可引起酶活性的改變，導致個體腫瘤易感性的差異。本文擬對吸煙與Ⅰ相代謝酶細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）

1A1-MspⅠ、Ⅱ相代謝酶谷胱甘肽硫轉移酶（gluta-

thione S-transferase，GST）T1基因多態性的關系進行研究，探討吸煙和CYP1A1-MspⅠ、GSTT1基因多態性與口腔癌的相關性。

1 材料和方法

1.1 研究對象及相關資料

選擇2006年6月—2010年5月在新鄉醫學院第一附屬醫院收治的口腔癌患者300例為研究對象，所有患者均經病理學確診為原發性口腔鱗狀細胞癌或腺泡細胞癌。對照組300例選自健康體檢人群，要求無腫瘤及遺傳性疾病。兩組的年齡、性別、民族、籍貫等基本情況經統計學檢驗無明顯差異，并且無血緣關系。調查兩組研究對象的人口學資料、吸煙史、職業史和家族腫瘤史。吸煙狀況由吸煙指數（smoking index，SI）來評估。SI的值為每天吸煙支數與吸煙年

數之積。根據SI值，本研究將研究對象分為不吸煙者、SI≤400者和SI>400者。每人各抽取靜脈血2～

3 mL，置于含乙二胺四乙酸的抗凝管中，分離白細胞層。用QIAampDNA提取試劑盒（QIAgen公司，德國）提取白細胞DNA，置于-30 ℃低溫冰箱中保存備用。

1.2 基因測定

1.2.1 CYP1A1-MspⅠ多態性分析 本研究引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列為：5’-CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT-3’和5’-TAGGA-GTCTTGTCTCATGCCT-3’。聚合酶鏈反應（polyme-

rase chain reaction，PCR）體系總量為25 μL，包括10×

buffer 2.5 μL、1 mmol·L-1 dNTP 2.5 μL、15 μmol·L-1引物1 μL、Taq DNA聚合酶0.75 μL、模板DNA 2 μL。以上試劑均購自美國Promega公司。于PE480 PCR儀（PE公司，美國）中進行PCR擴增。擴增參數：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，循環35次后，72 ℃延伸7 min。取PCR擴增產物5 μL，1.5%瓊脂糖凝膠（大連寶生物工程有限公司）電泳。電泳電壓100 V，時間1 h。電泳后溴化乙錠

（ethydium bromide，EB）染色30 min，紫外線分析儀下觀察擴增結果。取PCR產物10 μL，加入MspⅠ內切酶（大連寶生物工程有限公司），酶切反應體系總量30 μL，包括PCR產物10 μL、10×buffer 2 μL、MspⅠ內切酶10 U，37 ℃孵育3 h。酶切后產物點樣于1.5%瓊脂糖凝膠中，100 V電泳1 h，EB染色30 min后分析結果。酶切后分為3種基因型（圖1）：野生型（m1/m1）

為340 bp，雜合型（m1/m2）為340、200、140 bp，突變純合型（m2/m2）為200、140 bp。

1.2.2 GSTT1多態性分析 用多重PCR技術同時檢測GSTT1基因，β-globin為內對照。參照相關文獻[1]，

分別構建GSTT1和β-globin基因的擴增引物。擴增GSTT1的引物為：5’-TCTCCTTACTGGTCCTCAC-ATCTC-3’和5’-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3’；

擴增β-globin的引物為5’-CAACTTCATCCACGTTC-ACC-3’和5’-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3’。引物由上海Sangon公司合成。PCR體系為25 μL，其中10×buffer 2.5 μL，4×dNTP 1 μL，25 mmol·L-1 MgCl2 3 μL，50 μmol·L-1引物1 μL。擴增參數：95 ℃預變性5 min，然后95 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR

擴增產物作2%瓊脂糖凝膠電泳。加入DL 2000 Mar-

ker，40 min后于紫外線透射分析儀上觀察結果。DNA樣本經PCR擴增后產生480 bp片段者為GSTT1陽性

（+），無相應擴增產物者為純合子基因缺失即GSTT1陰性（-）（圖2）。

1.3 統計方法

分別計算病例組和對照組的GSTT1和CYP1A1- MspⅠ基因型分布，兩組間的差異采用四格表?掊２檢驗，各基因型口腔癌風險的調整比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區間（confidence interval，CI）通過非條件Logistic回歸模型進行分析，兩個基因間的聯合作用及兩者與吸煙的聯合作用通過Logistic回歸模型計算。采用SPSS 11.0統計軟件包進行統計分析。

2 結果

2.1 研究對象的一般情況

病例組和對照組的一般情況見表1。由表1可見：2組性別比例和年齡的差異無統計學意義（P>0.05），

而吸煙狀況的差異則有統計學意義（P<0.01），符合

本研究要求。

2.2 CYP1A1-MspⅠ、GSTT1基因型分布情況及兩

者與口腔癌易感性的協同分析

病例組與對照組的基因型分布見表2：2組

CYP1A1-MspⅠ突變純合型（m2/m2）分別占38.33%

和21.00%，差異有統計學意義（P<0.01）；2組GSTT1

（-）者分別占69.33%和44.33%，差異亦有統計學意義

（P<0.01）。2種基因型與口腔癌易感性的協同分析結果見表3：CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）/GSTT1（-）在病例組占30.67%，而對照組僅占6.67%；攜帶基因組合CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）/GSTT1（-）者的口腔癌患病比例是CYP1A1-MspⅠ（non-m2/m2）/GSTT1（+）者的8.27倍，2個基因型之間存在協同作用。

2.3 口腔癌的易感性與吸煙的相關性分析

將對照組與病例組的吸煙人數和不吸煙人數進行?掊２檢驗，結果見表4：口腔癌的發生與吸煙有相關性，吸煙者更易患口腔癌（OR=2.71，95%CI 1.31～4.52，

P<0.01）?？谇话┮赘行耘cSI的相關性分析見表4：大量吸煙者（SI>400）較吸煙較少者（SI≤400）更易患口腔癌（OR=6.16，95%CI 3.57～7.48，P<0.01）。

2.4 CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）、GSTT1（-）和吸煙與

口腔癌易感性的協同分析

病例組中攜帶CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）/GSTT1（-）基因和吸煙者明顯較對照組多，CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）/GSTT1（-）吸煙者占病例組的29.33%，而在對照組中僅占2.67%，其差異有統計學意義（P<0.01）

（表5）。

SI與CYP1A1-MspⅠ/GSTT1和口腔癌易感性的協同分析顯示：CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）/GSTT1（-）/SI>400組合的患病比例是CYP1A1-MspⅠ（non-m2/m2）/GSTT1（+）/SI≤400組合的229.50倍，其差異有統計學意義（P<0.01）（表6）。

3 討論

口腔癌的發生是諸多病因和宿主易感性相互作用的多步驟過程。流行病學調查[2]表明：吸煙與口

腔癌的發生存在著明顯的相關關系。大多數環境致癌物在體內都需要代謝激活后才有致癌性，煙草中

的許多前致癌物同樣需要經過體內Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶的活化和解毒。CYP1A1是重要的Ⅰ相代謝酶之一，可催化乙醛等外來化合物進入體內的Ⅰ相氧化反應，把無活性的前致癌物激活轉變為親電子化合物，該親電子化合物可攻擊細胞內的生物大分子，與DNA或蛋白質形成加合物，最終引起癌基因和抑癌基因的改變，從而導致癌變[3]。CYP1A1基因定位

于人類染色體15q22224，包含7個外顯子和6個內含子。CYP1A1的表達受基因的控制和環境因素的誘導，其本底表達和誘導表達水平均有顯著的個體差異，其3’端非翻譯區的T6235C可置換產生一個MspⅠ酶切

位點，即MspⅠ多態性。突變基因的存在可能是通過與該基因調節區其他多態性的連鎖而影響CYP1A1的誘導性[4]。MspⅠ多態性具有3種基因型：野生型（m1/

m1）、雜合型（m1/m2）和突變純合型（m2/m2）。已有研究[5-6]認為MspⅠ位點的多態性與喉癌、胃癌、乳

腺癌、前列腺癌等腫瘤的易感性有關。本研究發現：CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）基因型者發生口腔癌的風險明顯增加，其OR值為2.34，95%CI為1.76～4.07，與上述研究結果一致。CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）基因型者易患口腔癌的機制還不清楚。有研究發現m2基因型的酶活性高于m1基因型[7]，推測m2/m2純合子易患口

腔癌的原因可能是此種基因型者體內CYP1A1活性較高，可產生更多的活性致癌物[8]。

GST屬于Ⅱ相代謝酶，能催化親電子致癌物與谷胱甘肽結合，形成易溶于水的化合物排出體外，是與毒物或致癌物的解毒代謝有關的酶類。GSTT1、GSTM1基因分別編碼GSTθ、GSTμ 2個亞型，且具有基因多態性，其無效基因型，即缺失基因型GSTT1（-）、GSTM1（-）可引起相應酶表達缺失或活性降低，導致解毒功能改變，從而增加特定腫瘤的發病風險[9]。研究[10-11]證明：GSTT1、GSTM1基因多態性與多種腫瘤發病風險有關。GSTT1與GST家族其他成員不同，不僅存在于肝臟中，還存在于紅細胞中，使得紅細胞成為一個解毒場所。與GSTM1相比，GSTT1在人體致癌物解毒方面承擔著更重要的功能，主要涉及低相對分子質量毒物的轉化。GSTT1編碼酶的缺失導致其相應作用底物的解毒障礙，增加人群暴露于上述致癌毒物的危險性。

本研究發現：GSTT1（-）與口腔癌的發生有關，

攜帶GSTT1（-）基因者患口腔癌的風險高于GSTT1（+）的個體（OR=2.84，95%CI為1.98～4.54），GSTT1（-）與

CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）對口腔癌的發生有顯著的協同作用，基因組合CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）/GSTT1（-）

的口腔癌患病比例是CYP1A1-MspⅠ（non-m2/m2）/

GSTT1（+）的8.27倍。此外，本研究發現吸煙與口腔癌的易感性有關（OR=2.71，95%CI為1.31～4.52，P<0.01）。對CYP1A1-MspⅠ和GSTT1基因型與吸煙關系的協同分析發現：在口腔癌患者中攜帶CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）型基因且吸煙、GSTT1（-）基因且吸煙的人較對照組多，經統計學檢驗其差異有統計學意義（P<

0.01）；CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）/GSTT1（-）型吸煙者發生口腔癌的危險顯著增加（OR=25.00，95%CI為11.87～

35.64）。進一步對吸煙狀況進行分析，發現大量吸煙（SI>400）且為CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）與GSTT1（-）基因型者患口腔癌的相對危險度很高（OR=229.50，

95%CI為153.76～323.50），對于SI≤400且CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）/GSTT1（-）基因型者患口腔癌的風險（OR值）為2.70。由此可以看出，吸煙量越大，時間越長，口腔癌患病風險越大。

本研究結果提示攜帶CYP1A1-MspⅠ（m2/m2）和

GSTT1（-）的個體屬于口腔癌高危險人群，應予以重視。目前雖然還不能通過改變其腫瘤易感基因型來防治腫瘤，但可以根據其與環境病因相互作用的特點，采取相應的控制措施如戒煙以達到預防的目的。

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（本文編輯 吳愛華）