富血小板血漿對人成骨樣細胞MG63增殖能力的影響

[摘要] 目的 研究富血小板血漿（PRP）對人成骨樣細胞MG63增殖能力的影響，探討PRP的生物學功能。方法 采集健康志愿者的靜脈血，兩次離心法制備PRP，氯化鈣加人凝血酶激活后離心提取PRP萃取液。堿性磷酸酶（ALP）染色檢測不同體積分數PRP（0、1%、2%、3%）對MG63分化活性的影響，碘化丙啶（PI）熒光染色觀察PRP作用下MG63細胞形態的變化，免疫細胞化學檢測PRP對MG63表達轉化生長因子-β（TGF-β）的影響，掃描電子顯微鏡（SEM）觀察PRP對MG63在人工骨材料表面生長情況的影響，CCK-8法檢測PRP對MG63增殖活性的影響，流式細胞術（FCM）檢

測經PRP培養后不同時間MG63的細胞周期，逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測PRP作用下MG63中Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）mRNA的表達量。結果 ALP檢測見3%PRP組ALP陽性細胞染色最深，并隨體積分數的增加染色強度增加，且PRP組細胞均出現不同程度的脫片現象。PI熒光染色見PRP組細胞核熒光染色較對照組增強。免疫細胞化學檢測見3%PRP組TGF-β表達量最高（P＜0.05）。SEM觀察：PRP組材料表面MG63密集，生長狀態良好。CCK-8法測定細胞增殖活性，顯示4.8%PRP組吸光度A450 nm值高于對照組（P＜0.05）。FCM檢測表明：PRP組第2天S期細胞百分比高于對

照組（P＜0.05）；第10天PRP組G0/G1期細胞百分比高于對照組（P＜0.05）；除第6天外，PRP組G2/M期細胞百分比均高于對照組。RT-PCR結果表明：PRP組MG63的Col-ⅠmRNA表達量較對照組明顯上調。結論 適宜體積分數的PRP對MG63的增殖、遷移和相關蛋白、基因的表達有促進作用，PRP具有統一、協調細胞生物學行為的作用。

[關鍵詞] 富血小板血漿； 人成骨樣細胞MG63； 細胞增殖

[中圖分類號] Q 253 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.02.006

Effect of platelet rich plasma on the proliferation behavior of human MG63 osteoblast-like cells in vitro Wang Yue1， Liu Chunli2， Wang Jing3， Yang Xufang4， Zhou Yanmin1， Ma Yingzhi5. （1. Dept. of Implant Center， School of Sto-matology， Jilin University， Changchun 130021， China; 2. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery， School of Stomato-logy， Jilin University， Changchun 130021， China; 3. Dept. of Stomatology， Nanguan Traditional Chinese Medicial Ho-spital of Changchun City， Changchun 130041， China; 4. Dept. of Pathophysiology， Mudanjiang Medical College， Mu-danjiang 157011， China; 5. Clinic of Flight Training Base， Aeronautical University of Air Force， Changchun 130000， China）

[Abstract] Objective To assess the effect of platelet rich plasma（PRP） on proliferation and differentiation of hu-

man MG63 osteoblast-like cells and the biological function of PRP in vitro. Methods PRP was obtained from venous blood of a health volunteer by two step centrifugation. CaCl2 and thrombin were used to activate PRP. The differentia-tion of MG63 cells， which were exposed to various concentrations of PRP（0， 1%， 2%， 3%） was detected by alkaline

phosphatase（ALP） activity. Propidium iodide（PI） fluorescent coloration staining was used to observe the morphology of cells. Immunocytochemistry was used to evaluate the expression level of transforming growth factor-β（TGF-β） in MG63

cells in different concentration of PRP. The cells adhered to calcium phosphate material was observed by scanning electron microscopy（SEM）. The proliferation was evaluated by cell counting kit-8（CCK-8） proliferation assay. The cell cycle assay was performed by flow cytometry（FCM） to

detect the effect of PRP on MG63 cells in different time points. The mRNA level of Col-Ⅰ in MG63 cells cul-tured under different concentration PRP was checked by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.

Results ALP activity experiment demonstrated that the maximum effect was got in 3% PRP group. PRP had a posi-tive effect on the proliferation of MG63 cells but cells also presented disengage phenomena from the glass slides. The PI staining showed that PRP improved fluorescent intensity of cell nucleus. Immunocytochemistry showed that TGF-β expression level was significantly enhanced on 3% PRP group（P＜0.05）. SEM showed that cells grew well on material in PRP group. The results of CCK-8 showed that the mean absorbency number A450 nm of 4.8% PRP was significantly higher than that of control group（P＜0.05）. FCM showed that S period cells percentage of PRP group was higher than

that of control group in the 2nd day（P＜0.05）; G0/G1 period cells percentage of PRP group was significant increased than that of control group in the 10th day（P＜0.05）; G2/M period cells percentage of PRP group was higher than that of

control group except the 6th day. PRP promoted the expression of Col-Ⅰ in MG63 cells by RT-PCR. Conclusion These data suggest that PRP has a positive influence on MG63 proliferation， transference and the expression of relative protein and gene in an appropriated concentration. The findings of this study also demonstrated that PRP may play a beneficial role of unifying and modulating the biological behavior of MG63 cells.

[Key words] platelet rich plasma； human MG63 osteoblast-like cell； cell proliferation

富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）是一種經離心獲得的血小板含量高于正常全血4～5倍的血液提取物，體外激活后可釋放出多種組織修復所需的生長因子，如血小板衍化生長因子（platelet-derived

growth factor，PDGF）、轉化生長因子-β（transforming

growth factor-β，TGF-β）、血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）等[1]。因其源于患者自體，無免疫源性，且制備方便，所以常被用于外科領域以促進創傷愈合、促進成骨、加速組織修復，以及減少瘢痕等；在口腔醫學領域可促進拔牙窩愈合、加速骨改建、促進牙周組織再生等[2-3]。但有報道[4]指出：PRP的臨床療效存在不確定性，并沒有確切的治療作用。為此本實驗研究PRP對人成骨樣細胞MG63生物學行為的影響，探討PRP的生物學作用，為臨床應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

人成骨樣細胞MG63（上海中科院生物研究所）；低糖培養基LG-DMEM（Gibco公司，美國），優級胎牛血清（PAA公司，奧地利），胰酶、碘化丙啶（pro-pidium iodide，PI）（上海鼎國生物技術有限公司），

CaCl2（北京化學試劑廠）；CCK-8（cell counting kit-8）細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（北京貝博生物）；納米人工骨材料（北京奧精生物材料有限公司）；CO2孵箱（Thermo公司，德國），3 mL真空采血管（江蘇康健醫療用品公司），倒置相差顯微鏡（Olympus公司，

日本），低溫高速離心機（Thermo公司，德國）；BCIP/NBT堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）顯色試劑盒（碧云天生物技術研究所），酶標儀（BIO-RAD公司，美國），流式細胞儀（BD Biosciences公司，美

國），XL30 ESEM-FEG場發射環境掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（FEI公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 PRP制備 選擇1名健康志愿者，在無菌條件

下用含枸櫞酸鈉抗凝劑的3 mL采血管采集靜脈血

2 mL，置于低溫高速離心機中20 ℃下離心。第1次離心（3 000 r·min-1）4 min，全血分為血漿層、白膜層、紅細胞層[5]。吸取全部血漿、白膜層及其下1～2 mm

紅細胞層，移入另一無抗凝劑的采血管中，第2次離心（3 000 r·min-1）13 min，血液再次分層，吸去上層3/4血漿即貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP），余下的即PRP，約350 μL，置于EP管中，-80 ℃凍存。實驗時按體積比10∶1加入含人凝血酶500 U·mL-1的10%氯化鈣，其中氯化鈣中和抗凝劑，凝血酶激活血小板α顆粒；室溫靜置10 min，使生長因子充分釋放，再次離心（12 000 r·min-1）5 min，提取萃取液[6]

加入細胞培養基。

1.2.2 ALP染色[7] 實驗分4組。24孔板加1 cm×1 cm玻片，調整細胞懸液密度為每毫升1×105，每孔500 μL種板，長至60%～70%時加入體積分數分別為0（對照組）、1%、2%、3%的PRP。加PRP后第4天，4 ℃下75%乙醇固定10 min，ALP染色，倒置相差顯微鏡下觀察。細胞質中形成不溶性深藍色顆粒為ALP陽性，以藍色深淺表示細胞分化活性的強弱。

1.2.3 PI熒光染色 實驗分6組。細胞懸液密度為每毫升1×105，每孔3 mL接種于6孔板，培養24 h后加體積分數分別為0（對照組）、0.65%、1.3%、1.9%、

2.5%、3.1%的PRP。加PRP后第4天，70%乙醇固定10 min，PI避光染色30 min，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 免疫細胞化學檢測MG63細胞TGF-β表達[8] 實

驗分4組。24孔板加1 cm×1 cm大小的玻片，調整細胞密度為每毫升1×105，種板，長至60%～70%時加體積分數分別為1%、2%、3%、0（對照組）的PRP。

加PRP后第4天，采用免疫細胞化學SP法檢測MG63

中TGF-β表達。TGF-β抗體工作稀釋度為1∶100。細胞用4%多聚甲醛固定，枸櫞酸及枸櫞酸鈉熱修復，TritonX-100打孔，PBS代替一抗作為陰性對照，4 ℃過夜，次日二抗孵育，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，封片。Olympus A×70型顯微鏡采圖，100倍鏡下觀察，隨機選取5個視野，Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件分析結果。以細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性表達，以陽性信號強度即黃染區積分光密度（inte-

grated optical density，IOD）為參數行半定量測量。

1.2.5 SEM觀察PRP影響MG63在人工骨材料表面的生長情況 實驗分2組，每組6塊骨材料（10 mm×10 mm×1 mm）。細胞懸液密度為每毫升1×105，每孔500 μL種板。對照組加單純培養基，實驗組加2.8%PRP。種板前用不銹鋼絲將骨材料壓于孔板底部，培養基浸泡1 h，接種細胞，靜置10 min后放入孵箱。24 h后加PRP，加后72 h用4%戊二醛固定，鋨酸固定，乙醇梯度脫水，噴金，采用SEM觀察。

1.2.6 CCK-8法檢測細胞增殖活性[9] 實驗分5組，

每組5個復孔。細胞懸液密度為每毫升1×105，每孔

100 μL接種于4塊96孔板，孵育48 h后加體積分數分別為0（對照組）、0.6%、1.2%、2.4%、4.8%的PRP，加PRP后2、4、6、8 d每孔加10 μL CCK-8試劑，置于酶標儀上檢測各組吸光度A450 nm值。

1.2.7 流式細胞術（flow cytometry，FCM）檢測細胞周期 實驗分5組，每組設實驗組及對照組。實驗組加2.4%PRP，對照組加等量無血清培養基。密度為每毫升1×105的細胞懸液3 mL，加PRP后第2、4、6、8、10天收集細胞，4 ℃下70%乙醇固定1 h，PBS沖洗，每個樣本加500 μL PI，室溫避光染色1～2 h，FCM分析兩組間G0/G1、S及G2/M期細胞數量百分比[10]。

1.2.8 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-po-lymerase chain reaction，RT-PCR）檢測MG63中Ⅰ型膠原（collagen type-Ⅰ，Col-Ⅰ）mRNA表達量 實驗分4組。細胞懸液密度為每毫升1×105，接種于4個培養瓶，長至60%～70%時分別加入體積分數為0（對照組）、1%、2%、3%的PRP，加PRP后第8天，TRIzol試劑抽提各組細胞的總RNA，RT-PCR檢測MG63 Col-

Ⅰ mRNA的表達。引物序列如下：上游為5’-ATGG-ATTCCAGTTCGAGTATGGC-3’；下游為5’-CATC-GACAGTGACGCTGTAGG-3’。內參照β-actin的引物序列：上游為5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’；下游為5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。利用圖像分析軟件（ID Image Analysis Software）分析PCR產物和β-actin灰度比值，計算Col-Ⅰ的相對表達量。

1.3 統計學處理

采用Graph Pad Instat 3.1軟件進行統計學分析。免疫細胞化學積分光密度（IOD）、細胞周期G0 /G1、S和G2 /M各期細胞百分比和CCK-8法檢測的吸光度A450 nm值均以x±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 ALP染色

ALP染色結果見圖1。倒置相差顯微鏡觀察可見3%PRP組細胞染色最深，細胞質可見大量深藍色顆粒，表明細胞成骨分化活性最強，細胞密度最大，并有細胞增殖。與對照組相比，各組染色隨PRP體積分數的增加逐漸加深。另外，各PRP組均有不同程度的細胞脫片，且PRP體積分數越高，脫片越明顯，使圖像分析系統對細胞數量、染色面積數據的采集造成困難，但對染色深淺無明顯影響。實驗重復3次，結果與免疫細胞化學實驗相印證。

2.2 PI熒光染色

PI熒光染色結果見圖2。對照組MG63呈鋪路石樣伸展，隨PRP體積分數的增加，MG63細胞數量增加，密集成群。各PRP組細胞核熒光染色較對照組明亮，有絲分裂期的細胞數較對照組多。沒有發現細胞脫離塑料孔板底部。

2.3 免疫細胞化學檢測TGF-β表達

各組TGF-β均呈陽性染色（圖3），棕色顆粒集中

于細胞質。對照組細胞均勻伸展；PRP組玻片上的細胞出現不同程度的脫片，細胞呈網狀聚集，PRP體

積分數越高，聚集越明顯，染色越深。對照組、1%、2%、3% PRP組IOD值分別為655.40±20.10、736.20±11.45、790.35±25.20和856.30±21.20。3%PRP組明顯高于對照組，其差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 MG63在人工骨材料表面的生長情況

2.8%PRP組細胞在材料表面的數量多于對照組，細胞伸出偽足伸展良好（圖4左）；對照組材料表面細

胞增殖少，伸展不足（圖4右）。

2.5 CCK-8法檢測細胞增殖活性

CCK-8法檢測MG63細胞增殖活性（A450 nm值）結果

見表1。0.6%PRP組與對照組的A450 nm值無明顯差別（P＞0.05）；隨PRP體積分數的增加，A450 nm值增大；4個檢測時間內，4.8%PRP組A450 nm值較0.6%PRP組及對照組明顯增大，差異有統計學意義（P＜0.05）。加PRP后第4天與第2天相比，0.6%PRP組和1.2%PRP組A450 nm值明顯增大（P＜0.05）；第6天與第4天相比，2.4%PRP組

和4.8%PRP組A450 nm值明顯增大（P＜0.05）。

2.6 FCM檢測細胞周期的分布

加入2.4%PRP后，不同培養時間內MG63細胞周期的分布見表2。由表2可見：第2天PRP組S期和G2/M期所占百分比高于對照組（P＜0.05）；第4天PRP組

G2/M期所占百分比高于對照組（P＜0.05）：提示PRP促

進了MG63的增殖。第6～8天，PRP組和對照組G0/G1期和S期所占百分比均無明顯差異（P＞0.05）；但第6

天與第4天相比較，對照組和PRP組的G0/G1期所占百

分比明顯升高，而S期明顯降低（P<0.05）；第10天，

PRP組G0/G1期和G2/M期所占百分比均高于對照組（P＜

0.05）；除第6天外，PRP組G2/M期細胞百分比均高于對照組。

2.7 RT-PCR檢測結果

實驗各組均可見Col-Ⅰ在mRNA水平的表達（圖5），RT-PCR分析結果顯示對照組Col-Ⅰ的相對表

達量為0.55±0.02，1%組為1.04±0.06，2%組為0.87±0.03，3%組為1.04±0.02。由此可見：培養8 d后，MG63細胞Col-Ⅰ的mRNA表達較對照組明顯上調（P<0.05），但各PRP組之間的差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

近年來PRP被用于組織修復，但基礎和臨床研究結果存在較大差異。Kanno等[11]研究PRP對人成骨樣細胞SaOS-2和HOS增殖和成骨能力的影響，認為PRP促進細胞增殖和成骨相關基因表達。Giovanini等[12]研

究PRP聯合兔自體碎骨塊修復兔顱頂骨缺損，結果表明：PRP加骨塊的骨量和創傷周圍骨膠原分泌量明顯高于單用自體骨和單用PRP的對照組。Pantou等[13]將

5%PRP用于牙周膜細胞培養，發現PRP組比單用成纖維細生長因子更能促進細胞增殖。Torres等[14]將PRP覆蓋在鈦網表面，將鈦網結合無機小牛骨粉以增加牙槽骨骨量，結果表明PRP可促進軟組織愈合，降低鈦網暴露于口腔的概率。但是，Garcia等[15]研究PRP能

否增加噴砂酸蝕處理的種植體周圍骨形成，結果發現PRP組和對照組無明顯差別。Almdahl等[16]將患者

自體PRP滴加于隱靜脈切除創口，結果表明PRP未減少創口感染的發生率。

本實驗中ALP檢測結果表明：隨著PRP體積分數的增加，細胞染色逐漸加深，且細胞數量亦有增加。各PRP組MG63細胞出現脫片的原因，相關資料顯示：PRP中的PDGF是一種有絲分裂源，可刺激骨細胞分裂增殖，同時對成骨細胞、成纖維細胞、內皮細

胞有趨化作用[17]；另一種因子TGF-β在骨愈合過程中亦起到趨化因子的作用，能將骨母細胞吸附于種植體表面并促進體外培養的人牙髓干細胞的增殖和游走，以及基質分泌[18]。本實驗中在這兩種因子作用

下，MG63在光滑玻片表面出現游走性增強的現象。后續實驗表明：細胞脫片后，若及時更換無PRP的培養基，脫片的細胞可再次黏附于玻片表面。免疫細胞化學檢測PRP影響MG63表達TGF-β實驗中同樣出現細胞脫片現象，且加PRP后MG63表達TGF-β的量較對照組明顯增加。為進一步證實這種脫片不是PRP對MG63產生的抑制或殺傷作用，對相同培養條件下的6孔板中MG63細胞行PI染色，結果表明：各PRP組細胞伸展良好，均有增殖，細胞核熒光染色較對照組增強，細胞未脫離孔板底部，表明PRP對MG63無抑制、殺傷作用，且細胞對塑料培養板底部的黏附力大于細胞的遷移力。

檢測細胞增殖活性的CCK-8實驗表明：0.6%PRP對細胞增殖無促進作用，至體積分數為1.2%時才表現出PRP的促細胞增殖作用且吸光度A450 nm值持續升高至第8天。2.4%和4.8%PRP組在加PRP后第2天即表現出較高的促細胞增殖作用，但第2天和第4天無明顯變化，第4天至第6天，吸光度A450 nm值出現明顯增高，但第6至第8天再次無明顯差別。A450 nm值變化的可能原因是PRP體積分數較低時不同細胞周期的細胞按各自的周期增殖，細胞增殖變化緩慢，而體積分數較高時MG63的狀態被趨于統一，大多數細胞

按統一的細胞周期從G0/G1期的DNA合成前期，到S期

進行DNA合成，再進入G2期，此期合成大量蛋白質為有絲分裂期（M期）作準備。M期細胞分裂，細胞數

量明顯增加，出現第4至6天A450 nm值的顯著增加，而第6至8天A450 nm值無明顯變化。這一結果在細胞周期實驗中得到證實。細胞周期G0期和G1期為DNA合成前期，細胞有增殖活性，為二倍體DNA含量期；S期為DNA合成期，DNA含量增加至4倍體；G2期為DNA合成后期或有絲分裂前期，此期合成大量蛋白質為有絲分裂期（M期）作準備，G2和M為四倍體細胞期。本研究結果表明：加入2.4%PRP后第2天S期細胞百分比明顯高于對照組，表明處于DNA合成期的細胞數量多；第6天較第4天G0/G1期細胞百分比明顯增加；第6～8天PRP組和對照組G0/G1期和S期細胞無明顯差別。該結果與CCK-8的第6～8天A450 nm值無明顯變化相吻合。另外，除第6天外，PRP組的G2/M期均高于對照組，表明PRP組細胞處于大量合成蛋白質的分裂前期。第10天細胞分裂完成，PRP組的G0/G1期細胞百分比明顯高于對照組，細胞處于分裂后的靜息狀態，而對照組仍處于DNA合成期。RT-PCR檢測結果表明，PRP使MG63的Col-Ⅰ mRNA表達上調，而分泌Col-Ⅰ是成骨細胞成熟的重要標志。

本實驗結果表明：高體積分數的PRP表現出對細胞較強的促增殖作用，并存在體積分數的依賴性。體積分數適宜的PRP對人成骨樣細胞MG63的增殖、遷移和相關蛋白、基因的表達有明確促進作用，并有統一、協調細胞生物學行為的作用。相關文獻中報道的關于PRP的基礎和臨床研究中的不同結果可能是由于PRP制備工藝的不同，引起PRP中血小板含量的差異，導致生長因子量不同造成的，所以明確PRP的有效含量、規范PRP的制備標準是進一步研究的重點。

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（本文編輯 吳愛華）