載銀納米二氧化鈦樹脂基托對變異鏈球菌和白色假絲酵母菌抗菌性的體外研究

[摘要] 目的 采用體外法研究載銀納米二氧化鈦（Ag-TiO2）樹脂基托對口腔常見條件致病菌的單一游離菌體及菌斑生物膜的抗菌性能。方法 將不同質量分數的Ag-TiO2抗菌粉劑添加到樹脂基托材料中，制成抗菌樹脂基托。采用薄膜密貼法分別檢測該抗菌樹脂基托對變異鏈球菌、白色假絲酵母菌、金黃色葡萄球菌的抗菌率，并用掃描電鏡觀察抗菌樹脂基托表面變異鏈球菌、白色假絲酵母菌的生長情況。結果 與未添加抗菌劑相比，抗菌劑質量分數為0.7%時，抗菌樹脂基托對金黃色葡萄球菌的抗菌率達93.3%；抗菌劑質量分數為1.5%時，抗菌樹脂基托對變異鏈球菌的抗菌率達90.2%；抗菌劑質量分數為2.5%時，抗菌樹脂基托對白色假絲酵母菌的抗菌率也達91.2%。與未添加抗菌劑相比，抗菌樹脂基托表面變異鏈球菌、白色假絲酵母菌的黏附數量明顯減少。結論 Ag-TiO2可以顯著提高樹脂基托的抗菌性能。

[關鍵詞] 載銀納米二氧化鈦樹脂基托； 抗菌性能； 菌斑

[中圖分類號] R 783.6 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.02.022

Study of antibacterial effect of polymethyl methacrylate resin base containing Ag-TiO2 against Streptococcus mutans and Saccharomyces albicans in vitro Liu Jie1， Ge Yali1， Xu Lianli2. （1. Dept. of Prosthodontics， School of Stomatology， Jiamusi University， Jiamusi 154002， China; 2. Dept. of Denture Production， School of Stomatology， Jiamusi University， Jiamusi 154002， China）

[Abstract] Objective To study the antibacterial effect of polymethyl methyacrylate（PMMA） resin base containing

Ag-TiO2 antibacterial agent against common conditioned pathogen and their bacterial plaque in vitro. Methods Diffe-rent qualities of Ag-TiO2 antibacterial agent were added into PMMA resin base in order to prepare antibacterial PMMA resin base. Then， in vitro analysis of antibacterial effect of the resin base against Streptococcus mutans， Staphylococcus aureus， Saccharomyces albicans were assayed with the pellicle-sticking method. Furthermore， the growth of Streptococ-cus mutans and Saccharomyces albicans bacterial plaque on the antibacterial PMMA resin base were examined by scanning electron microscope. Results The inhibition percent for Staphylococcus aureus was 93.3% by antibacterial PMMA resin base with 0.7% Ag-TiO2; for Streptococcus mutans 90.2% with 1.5% Ag-TiO2; for Saccharomyces albi-cans 91.2% with 2.5% Ag-TiO2. Bacterial plaque of Streptococcus mutans and Saccharomyces albicans on antibacterial resin base were inhibited effectively. Conclusion The antibacterial property of the PMMA resin base is effectively enhanced with Ag-TiO2 antibacterial agent.

[Key words] polymethyl methacrylate resin base containing Ag-TiO2； antibacterial effect； bacterial plaque

隨著全球逐漸步入老齡化社會，佩戴活動義齒或全口義齒的患者越來越多。義齒的戴入常造成口腔原有微生態環境改變，導致口腔條件致病菌增多；聚甲基丙烯酸甲酯制成的人工牙及樹脂基托由于其獨特的理化性能，易黏附細菌、真菌且難以徹底清除，從而繼發一系列口腔疾病[1]。因此，如何提高義齒的抗菌性能是目前國內外關注的熱點之一。

近年來，無機抗菌劑憑借其抗菌譜廣、抗菌時效長、耐高溫、生物安全性好等特性得到國內外學者一致認可。無機抗菌劑中，一類是通過物理吸附、離子交換等方法，將銀、銅、鋅等抗菌金屬離子負載在沸石、硅膠等多孔材料表面制成的抗菌劑；另一類是利用材料自身光催化作用產生大量含氧自由基（reactive oxygen species，ROS）發揮殺菌作用的鈦類（TiO2）抗菌劑[2]。本研究將載銀納米二氧化鈦（Ag-TiO2）抗菌劑添加到樹脂基托中，采用體外實驗，探

討抗菌樹脂基托對變異鏈球菌、金黃色葡萄球菌、白色假絲酵母菌單一游離的細菌、真菌的抗菌作用，并用掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察抗菌樹脂基托表面菌斑生物膜的生長情況。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株

變異鏈球菌（Streptococcus mutans，ATCC257-

15）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATC-C29213）、白色假絲酵母菌（Saccharomyces albicans，ATCC90028）購自廣東微生物保藏中心。

1.2 主要材料和儀器

載銀納米二氧化鈦抗菌粉劑（中南大學冶金研究所提供，平均晶粒粒徑10～30 nm），賀利氏熱凝牙托粉與熱凝單體（日進齒科材料昆山有限公司），BHI培養液/培養基、沙堡培養液/培養基（無錫市賽維商貿有限公司），PE膜（天津市潤生塑膠制品有限公司），超凈工作臺（上海凈化設備廠），恒溫培養箱（天津市實驗儀器廠），血球計數板（鹽城市恒泰玻璃儀器廠），微量加樣器[研域（上海）化學試劑有限公司]，S-450型掃描電鏡（日立公司，日本）。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌液配置 用BHI培養液分別復蘇變異鏈球菌、金黃色葡萄球菌、白色假絲酵母菌凍干菌株。采用連續轉接2次之后的新鮮菌液培養物，挑取變異鏈球菌和金黃色葡萄球菌單菌落混懸于BHI培養液中，37 ℃下分別厭氧和需氧培養24 h；挑取白色假絲酵母菌單菌落混懸于沙堡培養液中，37 ℃下需氧培養24 h。血球計數板分別配置密度為1×105 CFU·mL-1的3種菌液，備用。

1.3.2 實驗樣品制備 根據《中華人民共和國輕工行業標準——抗菌塑料抗菌性能試驗方法和抗菌效果》

（QB/T 2591—2003）[3]中試件制備方法制備實驗樣品。

按照質量比，在100 g牙托粉中分別加入0.3、0.5、0.7、1.5、2.0、2.5 g的Ag-TiO2抗菌劑，球磨法混勻，即含抗菌劑的質量分數分別為0.3%、0.5%、0.7%、1.5%、2.0%、2.5%，按臨床常規制作熱凝型樹脂基托的方法制作規格為（50±2） mm×（50±2） mm×2 mm

的6組不同質量分數的抗菌劑樹脂基托，以未添加抗菌劑的樹脂基托作為空白對照組，每組6個。以上所有試件均用1 200目水砂紙打磨、拋光，備用。實驗前用70%乙醇擦拭樣品表面，1 min后無菌水沖洗，自然干燥備用。

1.3.3 薄膜密貼法檢測抗菌樹脂基托抗菌效果 參考《中華人民共和國輕工行業標準——抗菌塑料抗菌

性能試驗方法和抗菌效果》（QB/T 2591—2003）[3]，采用薄膜密貼法檢測抗菌樹脂基托抗菌率。將各組樣品置于直徑90 mm的培養皿內，分別取0.2 mL各菌懸液滴加在各樣品表面，PE膜覆蓋，鋪平，使菌液均勻接觸樣品。變異鏈球菌在37 ℃、相對濕度大于90%的情況下厭氧培養24 h；金黃色葡萄球菌和白色假絲酵母菌在37 ℃、相對濕度大于90%的情況下需氧培養24 h。之后，用20 mL PBS液反復洗脫各樣品和PE膜，充分混勻洗脫液，10倍稀釋至10-3，取0.1 mL洗脫液分別接種至BHI和沙堡平板培養基上。變異鏈球菌在37 ℃下厭氧培養24 h，金黃色葡萄球菌和白色假絲酵母菌在37 ℃下需氧培養24 h后，進行菌落計數。實驗重復3次。計算抗菌率R，R（%）=（空

白對照樣品平均回收菌落數-抗菌樣品平均回收菌落數）/空白對照樣品平均回收菌落數×100%。R≥99%為有強抗菌作用，R≥90%為有抗菌作用。

1.3.4 掃描電鏡觀察抗菌樹脂基托表面菌膜生長情況 將2.0 g抗菌劑添加至100 g牙托粉中，常規方法制備直徑為10 mm的抗菌樹脂基托小圓片，不含抗菌劑的樹脂基托為空白對照，每組3個。取最新配置密度為1×105 CFU·mL-1的變異鏈球菌、白色假絲酵母菌菌液各1 mL，分別置于2 mL BHI和2 mL沙堡培養基中，取2組樹脂基托各3個懸掛于菌液中，37 ℃下分別在厭氧和需氧環境中培養48 h；之后，取出試件，PBS液沖洗3次，戊二醛固定，乙醇梯度脫水，掃描電鏡觀察變異鏈球菌、白色假絲酵母菌在抗菌樹脂基托表面生長情況，并在2 000倍下隨機挑選計算10個視野下的菌落數，具體為：以半徑為5 μm的圓作為一個視野，選取每張圖片上左上角、右上角、左下角、右下角、正中央5個區域各2個視野的菌落數進行計數。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，對菌落數的差異進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 不同劑量抗菌劑的樹脂基托對口腔常見菌的抗

菌效果

添加Ag-TiO2的樹脂基托能有效抑制變異鏈球菌、金黃色葡萄球菌、白色假絲酵母菌的生長，菌落形成數與空白對照相比有統計學差異（表1），且隨著抗

菌劑質量分數的增加，抗菌率亦隨之提高。與空白對照相比，抗菌劑質量分數為0.7%時，抗菌樹脂基托對金黃色葡萄球菌的抗菌率達93.3%；抗菌劑質量分數為1.5%時，抗菌樹脂基托對變異鏈球菌的抗菌率達90.2%；抗菌劑質量分數為2.5%時，抗菌樹脂基托對變異鏈球菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率達99%

以上，對白色假絲酵母菌的抗菌率也達91.2%。

2.2 變異鏈球菌、白色假絲酵母菌在樹脂基托表面

生長情況

變異鏈球菌、白色假絲酵母菌在樹脂基托表面的生長情況見圖1。由圖1可見，與未添加抗菌劑的空白對照組相比，添加抗菌劑的樹脂基托表面黏附生長的變異鏈球菌和白色假絲酵母菌的數量明顯減少；未添加抗菌劑的樹脂基托表面這2種菌的菌體多黏附、聚集在一起，而添加抗菌劑的樹脂基托表面黏附的菌體大多相對獨立、分散。

變異鏈球菌在未添加和添加抗菌劑的樹脂基托表面黏附的菌數分別為52.5±4.6、8.3±3.8，白色假絲酵母菌在未添加和添加抗菌劑的樹脂基托表面黏附的菌數分別為69.1±3.2、24.7±5.1，統計分析表明，2種細菌在未添加抗菌劑與添加抗菌劑時黏附的菌數間有統計學差異（P＜0.05），與空白對照相比，抗菌

樹脂基托表面變異鏈球菌、白色假絲酵母菌的黏附數量明顯減少。

3 討論

各國學者很早便采用多種途徑來改善義齒樹脂基托的抗菌性能。Srinivasan等[4]對24例戴用全口義

齒的患者口腔進行了21 d觀察，發現使用義齒清潔劑的患者其口腔衛生明顯優于僅僅采用機械法清潔義齒的患者的口腔衛生。然而，清潔劑中有些成分會破壞樹脂基托材料，且有效藥物濃度持續時間短，限制了其應用。通過樹脂基托表面改性的方法（如上

釉、涂層、鍍膜等）也可改變樹脂基托表面理化特

性，減少菌斑黏附。李斌等[5]將納米非晶金剛石膜涂

覆于熱凝樹脂基托表面，發現二者結合牢固，生物相容性良好，薄膜高度透明、硬度高、耐腐蝕磨損，可以顯著降低白色假絲酵母菌黏附。Murata等[6]報道四季銨通過離子作用、疏水作用與細菌細胞膜作用可發揮殺菌效果，含四季銨的熱凝樹脂基托能有效地抑制其表面微生物，但抗菌劑呈暴發性釋放，有效濃度持續時間短，不耐高溫。

很早之前人們就認識到銀具有高效殺菌作用。有關銀對微生物的滅活機制主要有2種觀點：一種是接觸反應機制，帶正電的銀離子與帶負電的致病菌細胞膜接觸后，發生牢固的庫倫吸引，銀離子與細胞內部氧化代謝酶的巰基（-SH）發生反應，破壞微生物蛋白結構，微生物窒息死亡[7-8]；另一種是與光催化類（TiO2）抗菌劑相同抗菌機制的活性氧機制[9]。

無機抗菌劑中TiO2光催化類抗菌劑在接受長波

紫外線照射后，能在TiO2粒子表面產生大量ROS，如HO-、O2-、H2O2等，特別是強氧化性的HO-容易與致病菌細胞膜的脂質、細胞內的酶、核酸等生物大分子發生鏈式反應，滅活致病菌，并且還能將殺菌后有毒物質進一步代謝分解[10]。當Ag+嵌入到TiO2晶

體時，降低了TiO2光生電子的躍遷禁帶寬度，使TiO2抗菌劑不必依賴長波紫外線，在自然光條件下，即可發揮抗菌作用，實現二者協同抗菌[11]。當然，任

何抗菌劑在殺滅微生物同時對人體細胞也會產生一定毒副作用，關于Ag+的體內蓄積、對機體的毒性作用等也是學者們一直關注的。張富強等[12]通過體外細胞毒性試驗，比較6種納米載銀無機抗菌劑的生物安全性，指出抗菌劑質量分數小于等于25 g·L-1時，對人體安全無毒。陳良建等[13]研究也證實添加有2% Ag-TiO2的硅橡膠不僅對細胞無毒，而且有利于細胞黏附。本實驗選用結合納米材料特性、銀系、二氧化鈦系抗菌劑特性的Ag-TiO2作為抗菌劑添加到樹脂基托材料中。

檢測不同性質抗菌材料的抗菌性能，需要采用不同的檢測方法和評價手段，如抑菌環法、振蕩法、浸漬法、薄膜密貼法等[14]。根據《中華人民共和國輕工行業標準——抗菌塑料抗菌性能試驗方法和抗菌效果》（QB/T 2591—2003），對于抗菌型硬質表面的塑

料應采用薄膜密貼法檢測含有不同濃度抗菌劑的樹脂基托抗菌性能。本研究發現：與空白對照組相比，Ag-TiO2抗菌樹脂基托對其表面變異鏈球菌、白色

假絲酵母菌、金黃色葡萄球菌具有明顯抑制作用，且隨著抗菌劑添加劑量的增加，抗菌效果增強。這與其他學者的研究相符。Kuroki等[15]研究指出在自凝

樹脂中加入1%納米含銀抗菌劑后，能明顯抑制變異鏈球菌的殘存量和在樹脂表面的黏附量。李罡等[16]將

1.25%和2.5%納米載銀抗菌劑加入樹脂基托，有效地抑制了牙齦卟啉單胞菌和白色假絲酵母菌的生長，8%的抗菌劑可完全抑制口腔常見細菌生長。

導致口腔疾病發生的重要始動因子是牙菌斑，其致病性是游離單一致病菌的50～5 000倍。抗菌性能良好的樹脂基托不僅要能滅活單一致病菌，還要能防止菌斑生物膜的形成。本實驗用SEM觀察培養48 h后抗菌樹脂基托表面菌膜形成情況，發現與對照組相比，抗菌樹脂基托表面黏附生長的變異鏈球菌、白色假絲酵母菌明顯減少。

牙菌斑生物膜的形成歷經黏附、共聚、菌斑成熟3個階段，菌膜的形成需要大量單個游離微生物不斷堆積，數量和密度達到一定閾值后才產生群體致病效應。抗菌樹脂基托在菌膜形成前就可以顯著抑制致病菌生長，減少其數量，從而對菌膜的形成有

抑制作用。Ebi等[17]將添加有抗菌黏結單體甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡啶的復合樹脂置于1×106 CFU·mL-1變異鏈球菌菌懸液中，培養24 h后，與對照組相比，抗菌復合樹脂能有效地抑制其表面變異鏈球菌菌膜的形成。本研究結果與之相符。

菌斑生物膜的形成是有多種因素參與的復雜過程。例如，致病菌細胞表面蛋白特異性、致病菌存在的時間、菌液濃度、流體動力因素、表面材料的理化性質、細菌表面鞭毛、菌毛等。李罡等[16]研究報道：在16 d時間里，含銀抗菌劑的樹脂基托未能抑制細菌在其表面黏附。與之相比，本實驗觀察菌膜時間短，添加的抗菌劑種類不同，抗菌劑顆粒粒徑也不同，從而導致實驗結果存在差異。

本實驗表明：在樹脂基托材料中添加Ag-TiO2抗菌劑能有效提高樹脂基托抗菌作用，且添加劑質量分數為2.5%時對變異鏈球菌、白色假絲酵母菌、金黃色葡萄球菌的抗菌效果均較好；與對照組相比，Ag-TiO2樹脂基托對其表面菌膜形成有抑制作用。但是，由于體外實驗環境與口內復雜的微環境相距較大，例如，薄膜密貼法會影響白色假絲酵母菌需氧生長的條件，在口內這種光照不充足條件下Ag+和TiO2又是如何發揮協同抗菌效應，抗菌樹脂基托的機械性能和顏色如何等等，仍需要進一步地深入研究。

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（本文編輯 李彩）