牙齦卟啉單胞菌PG0839基因突變株的構建

[摘要] 目的 構建牙齦卟啉單胞菌毒力島基因PG0839突變菌株，為研究PG0839基因功能提供實驗基礎。方法 擴增1 584 bp PG0839基因片段，對聚合酶鏈反應（PCR）產物和pUC19載體進行BamH Ⅰ和EcoRⅠ雙酶切，連接酶

切產物得到質粒pPG0839-1。將2 101 bp erm基因產物插入到pPG0839-1中PG0839基因的EcoRⅤ位點，構建質粒pPG0839-2，作為電穿孔的供體質粒。電穿孔轉化于受體菌牙齦卟啉單胞菌W83菌株，紅霉素抗性培養基篩選陽性克隆，命名為PG0839基因突變菌株。結果 運用插入失活方法構建PG0839基因突變菌株，進而通過酶切、測序、PCR和反轉錄PCR對PG0839基因突變菌株進行驗證，證實PG0839基因突變菌株構建成功。結論 本實驗成功構建PG0839基因突變菌株。

[關鍵詞] 牙齦卟啉單胞菌； 毒力島； 基因打靶

[中圖分類號] R 781.5 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.02.020

Construction PG0839 gene-defective mutant of Porphyromonas gingivalis Liu Jingbo1， Pan Yaping1， Li Chen1， Lin Li1， Zhong Ming2，3. （1. Dept. of Periodontology， School of Stomatology， China Medical University， Shenyang 110002， China; 2. Central Laboratory， School of Stomatology， China Medical University， Shenyang 110002， China; 3. Dept. of Oral Pathology， School of Stomatology， China Medical University， Shenyang 110002， China）

[Abstract] Objective In order to determine the function of PG0839 gene from Porphyromonas gingivalis（P.gin-

givalis） W83 strains， we intended to create a mutant in the PG0839 gene by homologous recombination. Methods 1 584 bp PG0839 gene fragment was amplified， digested by BamH Ⅰ and EcoR Ⅰ， purified and ligated to pUC19. The recombinant plasmid was designated as pPG0839-1. The erm cassette（2 101 bp） was inserted into the EcoR Ⅴ restric-

tion site of the PG0839 gene. The resultant recombinant plasmid， pPG0839-2， was used as a donor in the electropo-ration of P.gingivalis W83. After electroporated and selected on erythromycin brain heart infusion plates， a single colony was collected and designated as PG0839 gene-defective mutant. Results A mutant in PG0839 gene was created by insertional inactivation， and inactivation of PG0839 gene was confirmed by restriction endonuclease digestive， sequen-cing， polymerase chain reaction（PCR） and reverse transcription PCR. Conclusion A PG0839 gene-defective mutant

was created successfully.

[Key words] Porphyromonas gingivalis； pathological islands； gene targeting

病原菌毒力島是指編碼細菌毒力基因簇的相對分子質量較大的染色體DNA片段。通過基因水平轉移，細菌獲得毒力島基因。毒力島編碼不同功能的毒力相關基因，影響細菌的毒力變化。PG0839基因是牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gin-

givalis）W83菌株PG0819—0844毒力島中的重要部分。在慢性牙周炎患者P.gingivalis陽性的齦下菌斑標本中，毒力島基因PG0839檢出與牙周探診深度和探診出血指數之間的關系存在統計學意義，提示該基因

可能是慢性牙周炎的致病性基因[1]。目前許多學者通

過反向遺傳學方法進行基因功能研究，即構建目的基因敲除菌株后，通過對突變株表型變化的研究，獲得目的基因與細菌表型之間的相關性，從而獲知基因的功能[2]。本研究擬遵循反向遺傳技術路線，運用

等位基因重組技術構建PG0839基因突變菌株，為研究毒力島基因PG0839的功能奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、儀器和實驗菌株

腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養基（Di-fco Laboratories，美國）；DNeasy Tissue Kit（Qiagen公司，德國）；PrimeSTAR HS DNA聚合酶，DNA A-Tailing試劑盒，Dephospharylation（BAP）試劑盒，DNA片段純化試劑盒，DL 2000 DNA Marker，λ-Hind

ⅢDNA Marker，pUC19載體，引物（大連寶生物工程有限公司）；TGRADIENT型PCR擴增儀（Biometra公

司，德國）；ECM630型電穿孔儀（BTX公司，美國）。

本研究采用了4種菌株。P.gingivalis W83由美國佛羅里達大學牙科學院口腔微生物研究所Lamont RJ教授惠贈，P.gingivalis ATCC 33277和變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）ATCC 2517由首都

醫科大學口腔醫院提供，大腸桿菌（Escherichia coli，

E.coli）JM109購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 細菌培養

P.gingivalis W83菌株接種于新鮮配制的含有5%無菌脫纖維羊血、氯化血紅素（5 μg·mL-1）和維生素K（0.5 μg·mL-1）的BHI培養基，37 ℃厭氧培養5～7 d（10% H2、10%CO2、80%N2）[3]。E.coli JM109菌株接種于Luria-Bertani（LB）培養基，37 ℃需氧培養。

1.3 P.gingivalis的檢測

提取P.gingivalis W83菌株DNA。使用P.gingivalis 16S rRNA特異性引物序列[4]進行聚合酶鏈反應（poly-merase chain reaction，PCR）。P1：5’-TGTAGAT-GACTGATGGTGAAAACC-3’，P2：5’-ACGTCAT-CCACACCTTCCTC-3’，預期產物片段為197 bp。PCR反應條件為預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 45 s，退

火58 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，經35個循環后，延伸72 ℃ 10 min。分別以S.mutans ATCC 2517和等體積無菌去離子水作為PCR反應的陰性和空白對照。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1.4 PG0839基因的擴增及克隆

1.4.1 PG0839基因擴增和純化 根據PG0839基因序列（GenBank No：AE015924），使用Primer Premier

5.0軟件設計引物，使用BLAST對引物進行同源性分析。P3：5’-CGGGATCCAGACTATCCCCTCGCCGT-AT-3’，P4：5’-CGGAATTCTCCTCTATTACTCCC-GCACT-3’。斜體部分分別為BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點。預期產物片段為1 584 bp（897 009～898 592 bp）。反應條件為預變性94 ℃ 2 min，變性98 ℃ 10 s，退火55 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 90 s，經30個循環后，延伸72 ℃ 7 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。純化PCR產物，大連寶生物工程有限公司測序。

1.4.2 載體酶切、連接和轉化 PCR產物或pUC19載體經BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后，將純化后的PCR產物和載體連接，連接產物熱轉化至E.coli JM109感

受態細胞中，篩選陽性克隆后增菌，提取質粒后測序。將測序結果與GenBank中序列進行同源性比對分析，基因編碼區與參考序列一致，將該質粒命名為pPG0839-1。

1.5 質粒pPG0839-2的構建

1.5.1 erm特異性引物PCR擴增 質粒pVA2198（Gen-Bank No：AF219231）中包含紅霉素抗性基因，可以在E.coli和P.gingivalis中表達出紅霉素抗性，由Wang BY教授（紐約州立大學布法羅分校牙學院口腔生物

系）惠贈。

erm特異性引物[5]，P5：5’-TATTAGGCCTATA-GCTTCCGCTATT-3’，P6：5’-AATAGGCCTTAGT-AACGTGTAACTTT-3’，斜體部分為Stu Ⅰ酶切位點。預期產物片段為2 101 bp（11～2 111 bp）。PCR反應條件為預變性98 ℃ 2 min，變性98 ℃ 10 s，退火55 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 90 s，經30個循環后，延伸72 ℃ 10 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。切膠純化后，產物進行加A反應。

1.5.2 質粒pErm的構建和酶切 將精制后的PCR產物和pMD19-T simple載體連接，連接產物熱轉化至E.coli JM109感受態細胞中，篩選陽性克隆后增菌，提取質粒，命名為pErm，由大連寶生物工程有限公司測序。質粒pErm經Stu Ⅰ酶切后，得到2 101 bp的erm基因和2 692 bp的載體片段，回收2 101 bp目的片段。

1.5.3 質粒pPG0839-2的連接和轉化 使用EcoR Ⅴ酶切pPG0839-1，酶切產物為線性片段（在目的基因中存在一個EcoR Ⅴ酶切位點，位于898 406 bp處）。將純化的酶切產物使用Dephospharylation（BAP）試劑盒進行去磷酸化處理后，命名為pPG0839-1-EcoR Ⅴ（BAP）。使用DNA連接試劑盒連接純化的pPG0839-1-EcoRⅤ（BAP）和2 101 bp的erm基因片段。兩者平末端連接，將erm基因插入到目的基因之中，構建成為一個新的質粒。回收目的載體和片段，將精制后的PCR產物和載體連接，連接產物熱轉化至E.coli JM109感受態細胞中，挑取單菌落進行PCR檢測，篩選反向陽性克隆。提取質粒DNA后，使用Hind Ⅲ進行正反向酶切鑒定。同時，將質粒DNA送至大連寶生物工程有限公司測序。將測序結果與GenBank中序列進行同源性比對分析，與參考序列一致。將質粒命名為pPG0839-2，該質粒擴增純化后用于電穿孔轉化。

1.6 載體的電穿孔轉化[5]

將1 mL處于對數生長期的P.gingivalis W83菌液接種于10 mL新鮮配制的BHI液體培養基中，37 ℃厭氧培養過夜。取3 mL過夜培養的菌液加入到90 mL新鮮配制的BHI液體培養基（預加熱至37 ℃）中，孵育4 h。

3 000 g、4 ℃離心15 min以收集細菌細胞，50 mL電穿孔緩沖液（10%甘油加1 mmol·L-1 MgCl2，過濾除

菌，4 ℃保存）洗滌2次后，0.5 mL電穿孔緩沖液重懸細胞沉淀。將100 μL細胞懸液和1 μg DNA共同加入

到一個無菌電極杯中，電穿孔脈沖為2 440 V、5 ms，電穿孔后，冰浴5 min。

1.7 突變株的篩選

將細胞懸液接種于1 mL BHI液體培養基，37 ℃厭氧培養16 h后，取300 μL菌液接種于新鮮配制的抗性BHI培養基（含5 μg紅霉素），記為實驗組；分別

在抗性和非抗性BHI培養基上接種P.gingivalis W83菌株，作為對照組1和2。37 ℃厭氧培養7 d。收集實驗組中陽性克隆菌體，即為PG0839基因突變菌株。

1.8 突變株的檢測

1.8.1 P.gingivalis 16S rRNA特異性引物檢測 提取細菌DNA。對PG0839基因突變菌株進行P.gingivalis 16S rRNA特異性引物P1和P2的PCR擴增檢測。P.gin-givalis W83和ATCC 33277為陽性對照，S.mutans AT-CC 2517為陰性對照，等體積無菌去離子水為空白對照。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8.2 erm基因引物檢測 分別對質粒pVA2198 DNA和PG0839基因突變菌株進行erm基因引物P5和P6的PCR擴增檢測。預期產物片段均為2 101 bp。P.gin-givalis W83為陰性對照，等體積無菌去離子水為空白對照。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8.3 PG0839引物檢測 分別對PG0839基因突變菌株和P.gingivalis W83進行PG0839基因引物P3和P4

的PCR擴增檢測。預期產物片段長度分別為3 685 bp

（2 101 bp+1 584 bp）和1 584 bp。P.gingivalis ATCC 33277為陰性對照，等體積無菌去離子水為空白對照。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8.4 PG0839基因反轉錄PCR檢測 提取細菌總

RNA，調整RNA質量濃度至100 ng·μL-1。使用Pri-mer Premier 5.0軟件設計引物，使用BLAST對引物進行同源性分析。P7：5’-AAAGCGAATGTGGATAGG-

3’，P8：5’-CTATCCCATTAGGCAAGG-3’，預期產物片段為742 bp（897 662～898 403 bp）。30 ℃反轉錄

10 min，保溫42 ℃ 60 min，升溫至70 ℃，保持15 min后冰上冷卻。PCR反應條件為預變性98 ℃ 2 min，變性98 ℃ 10 s，退火55 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 60 s，經30個循環后，延伸72 ℃ 7 min。P.gingivalis 16S rRNA作為反應的內參照。分別以P.gingivalis W83、ATCC 33277和等體積無菌去離子水為反轉錄PCR反應的陽性、陰性和空白對照。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.9 細菌生長情況的測定

培養P.gingivalis W83和PG0839基因突變菌株，分別在2、4、8、12、16、22、28、32、48 h時取菌液，使用紫外分光光度計測量600 nm處光密度值。

2 結果

2.1 PG0839基因的克隆和載體連接

PG0839基因特異性引物PCR擴增產物電泳圖如圖1所示。產物片段長度為1 584 bp，包含PG0839全長基因和部分上游和下游的非編碼DNA片段。P.gin-givalis PG0839 PCR產物和pUC19載體經BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切，P.gingivalis PG0839 PCR產物酶切后片段長度為1 584 bp，pUC19載體酶切后片段長度為2 664 bp。質粒pPG0839-1測序與GenBank中序列進行同源性比對分析，基因編碼區序列與參考序列相符。

2.2 質粒pPG0839-2的構建

2.2.1 erm基因的擴增 erm基因特異性引物PCR擴增產物電泳圖如圖2所示。產物片段長度為2 101 bp。經過加A反應和純化處理后的erm PCR產物和pMD19-T simple載體連接，連接后質粒命名為pErm。質粒pErm測序結果與GenBank中erm基因序列進行同源性比對分析，與參考序列相符。

2.2.2 質粒pErm的酶切 質粒pErm經Stu Ⅰ酶切后，得到酶切產物長度分別為2 101 bp和2 692 bp，如圖3所示。質粒pPG0839-1經EcoR Ⅴ酶切后，得到約為3 700 bp的產物片段。將酶切產物回收純化和去磷酸化處理后，命名為pPG0839-1-EcoR Ⅴ（BAP）。取

5 μL pPG0839-1-EcoR Ⅴ（BAP）進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖4所示。

2.2.3 質粒pPG0839-2鑒定結果 連接pPG0839-1-EcoR Ⅴ（BAP）和載體構建質粒pPG0839-2。使用Hind Ⅲ對質粒pPG0839-2進行正反向酶切鑒定，酶切產物電泳圖如圖5所示。質粒pPG0839-2測序結果與Gen-Bank中序列進行同源性比對分析，與參考序列相符。

2.3 菌株篩選結果

厭氧培養7 d后，實驗組可見白色、光滑的陽性

菌落生長；對照組1未見細菌生長，不僅表明P.gingi-valis W83菌株不具有紅霉素抗性，而且證實紅霉素在細菌培養基中有效；對照組2可見產黑色素圓形菌落生長，符合P.gingivalis菌落形態特征，為P.gingi-valis W83菌株。

2.4 突變株PCR檢測結果

2.4.1 P.gingivalis的檢測結果 PG0839基因突變菌株16S rRNA特異性引物PCR擴增產物電泳圖如圖6所示。產物片段長度為197 bp。結果可見PG0839基因突變菌株為P.gingivalis。

2.4.2 erm基因的檢測結果 PG0839基因突變菌株erm基因引物PCR擴增電泳圖如圖7所示。產物片段長度為2 101 bp。結果可見PG0839基因突變菌株基因組DNA中存在erm基因片段。

2.4.3 PG0839基因的檢測結果 PG0839基因突變菌株PG0839基因引物PCR擴增產物電泳圖如圖8所示。P.gingivalis W83菌株的PG0839產物為1 584 bp，而PG0839基因突變菌株的PG0839產物為3 685 bp。結果可見：PG0839基因突變菌株基因組DNA中存在PG0839基因片段，但是該片段中插入了2 101 bp的erm基因片段。

2.4.4 反轉錄PCR檢測結果 PG0839基因突變菌株PG0839基因引物反轉錄PCR擴增電泳圖如圖9所示。PG0839反轉錄PCR產物為742 bp，內參照P.gingivalis 16S rRNA反轉錄PCR產物為197 bp。結果可見PG0839基因突變菌株為P.gingivalis，但是該菌株PG0839基因未轉錄為相應的RNA。

2.5 菌株生長情況

兩個菌株在12 h均進入對數生長期。PG0839突變菌株和P.gingivalis W83生長速度的差異無統計學意義（U=25.50，P=0.19）。

3 討論

牙周炎是我國成年人失牙的主要原因之一，并與一些系統性疾病密切相關[6]。P.gingivalis在牙周炎的病因學研究中，被認為是重要的牙周可疑致病菌之一，與牙周炎的發生、發展和復發密切相關。PG0839基因（GenBank ID：AAQ65990）全長1 182 bp，編碼假

定的保守蛋白，為毒力島中的重要部分。PG0839基

因中包含著高毒力株P.gingivalis W83菌株特有而低毒力株P.gingivalis ATCC 33277中缺失的基因片段[7]。在前期研究[1]中，對P.gingivalis陽性的齦下菌斑標本進行檢測發現，隨著慢性牙周炎患者牙周組織炎癥程度的加重，PG0839基因檢出率呈現增高趨勢，提示該基因與P.gingivalis的致病性密切相關。對于P.gingi-valis毒力島PG0839基因的功能了解還停留在結構分析基礎上的推斷，因此P.gingivalis PG0839基因突變株的構建為研究該基因的功能奠定了堅實的基礎。

構建基因突變株是從分子生物學的角度對表達產物進行研究的最主要手段，導致基因突變的理論依據是借助插入復制突變載體，依靠同源重組將一段載體序列整合進入染色體。在P.gingivalis的轉化中，載體的選擇至關重要。近年來，一些研究小組已經構建了用于P.gingivalis的基因克隆載體，本次研究中使用的克隆載體pVA2198在P.gingivalis宿主中表達紅霉素抗性[8]。

使用同源基因DNA片段構建載體，可提高同源重組效率，構建能夠形成同源重組的質粒，首先應從P.gingivalis基因組DNA中克隆一段基因序列，該序列選擇在需要進行基因突變的部位。轉化質粒中同源序列的長度對重組成功率有重要影響：同源片段長度為300～2 500 bp時，隨著DNA片段長度的增加，同源重組效率呈指數增加[9]。但是在PCR克隆該片段時，如果選擇片段過長，錯配率會增加，也會影響同源重組的效率。本研究以PG0839基因為模板，選取包含完整的PG0839基因和少量上下游基因的目的片段，長度為1 584 bp，可以完整地擴增出野生型和突變后的該基因。

本次研究采用基因敲除的策略構建了PG0839基因的同源重組載體，電轉化到P.gingivalis W83菌株，通過載體中PG0839基因序列與基因組DNA的同源序列發生同源重組，使基因組中PG0839基因由于外源基因的插入而失活。外源插入基因為紅霉素抗性基因，在P.gingivalis W83菌株發生同源重組后，菌株

就表現出野生株不具備的紅霉素抗性。因此，可以

通過紅霉素抗性培養基來篩選陽性菌株。酶切、測序、PCR和反轉錄PCR實驗結果與預期相符，從基

因組DNA水平上說明外源基因erm已經成功插入到PG0839基因中。

同時，以P.gingivalis PG0839蛋白編碼序列為模板，設計反轉錄PCR引物，引物位于PG0839基因內部；經反轉錄PCR證實PG0839基因未能轉錄，實驗結果進一步證實PG0839基因失活菌株構建成功，為PG0839基因功能研究提供了有價值的細菌模型。

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（本文編輯 吳愛華）