阿卡波糖含量檢測方法的試驗分析

尹靈富

（臺州市疾病預防控制中心，浙江 臺州 318000）

1 實驗材料

（1）實驗原料：發酵液:阿卡波糖發酵液。

（2）實驗試劑：乙睛(色譜純）、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、純凈水、微孔濾膜、無水乙醇(分析純)、丙酮(分析純)、鹽酸、氫氧化鈉。

（3）實驗儀器：高效液相色譜儀、色譜柱、AT-330柱溫箱、磁力攪拌器、分析天平。

2 實驗方法

（1）HPLC檢測阿卡波糖含量方法的確立：①發酵上清液的獲得，離心:將發酵液在12000r/min下低溫離心10min得發酵上清液。②液相檢測條件的確定，文獻報道阿卡波糖在UV210nm處有吸收，并參考中國藥典阿卡波糖檢測條件流動相配比，經過多次實驗摸索初步確定的色譜條件如下：色譜柱:氨基柱sgar-D,size4.6X250mm、流動相:乙睛:PBS=70:30、檢測波長:210nm、流速:0.8m1/min、進樣量:20ul。③阿卡波糖標準品的線性考察。由于需要采用外標法或標準曲線法對阿卡波糖發酵液及其在樹脂柱的洗脫液進行含量計算，所以要考察阿卡波糖標準品的線性以便為準確計算含量提供可靠科學依據。標準品配制:用分析天平精確稱取一定量的阿卡波糖標準品，用重蒸水配成濃度分別100ug/ml,200ug/ml,300ug/ml、400ug/ml、500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml的溶液。將不同濃度的標準品用0.45urn的水膜過濾后可進行HPLC檢測。用上述液相檢測條件對不同濃度的標準品進行檢測，將濃度對峰面積作標準曲線。④HPLC檢測時稀釋倍數考察。取發酵上清液1ml用流動相分別稀釋成4倍、5倍、6倍、7倍、8倍后，于4000r/min轉速下離心10min后，取樣品上清液用0.45um的酷膜過濾后即可進行HPLC檢測，用500ug/ml的標準品做對照效價計算。

（2）阿卡波糖理化性質的考察。在提取過程中為保證生物效價不降低，對它的標準品和發酵上清液的一些理化性質如溶解性、穩定性及旋光性等進行了考察，為分離純化提供參考依據。

阿卡波糖標準品：①外觀:阿卡波糖標準品為白色粉末；②溶解度:極易溶于水，微溶于95%乙醇，不溶于丙酮、無水乙醇、乙睛。對其在水中的溶解度進行了考察。③穩定性考察。冰箱4℃冷藏，取濃度為500ug/ml阿卡波糖標準品(蒸餾水配制)置于冰箱4℃冷藏室，一個月取一次樣品，將樣品用0.45um的水膜過濾后進行液相檢測，考察效價變化。穩定pH值范圍，用0.2%鹽酸及0.2%氫氧化鈉將蒸餾水pH值分別調成為1.5,3,4.5,6,6.8、8.5,9.5,10.5,11.5的水溶液，用該水溶液分別配制濃度為600ug/ml阿卡波糖標品。對照品是用未調pH蒸餾水配制。配制完在室溫27℃放置二小時后取樣，將樣品用0.45um的水膜過濾后即可進行液相檢測，考察效價變化。熱穩定性，分別取15ml濃度為800ug/ml阿卡波糖標準品用稀鹽酸或稀堿調成pH分別為1.5，4，9，10的溶液。用旋轉蒸發儀溫度控制在47℃～49℃之間旋轉蒸發20min濃縮成體積都為8.5m1，將樣品用0.45um的水膜過濾后進行HPLC效價檢測。④旋光性，用0.2%鹽酸及0.2氫氧化鈉將蒸餾水調pH值分別為1.5，3，4.5，6，6.8，8.5，9.5，10.5，11.5的水溶液，用該水溶液配成濃度為3%的阿卡波糖標準品，用未調pH值的蒸餾水配制對照品。配完后在室溫27℃放置半小時，取樣進行旋光測定。

（3）阿卡波糖發酵上清液。由于在提取過程中需要調節發酵上清液的pH值便于樹脂吸附，所以要考察發酵上清液的pH值穩定性。同時在提取后期需要用旋轉蒸發儀濃縮洗脫液，這樣要考察發酵上清液的熱穩定性。并且在保藏方面要考察冰箱冷凍保藏發酵液的穩定性。所以針對上述這三點對其穩定性進行考察。①熱穩定性。取發酵上清液各1ml置于離心管中，放于水浴溫度分別為30℃、40℃、50℃水浴鍋中保溫1h，取出后按照2.1的方法進行液相檢測。然后取3份發酵上清液各1ml置于離心管中，在水浴47℃下分別放置20min、30min、40min，取出后同樣按照2.1的方法進行液相檢測。②保藏穩定性，將發酵上清液置于冰箱冷凍層-20℃冷藏，于1個月、2個月、3個月、4個月后取樣。取樣品后按照2.1的方法進行液相檢測。③穩定pH值范圍，用0.2%鹽酸、0.2%氫氧化鈉將發酵上清液pH調成4，5，6，8，9，10后放置2h，然后取樣品按照2.1的方法進行HPLC檢測，考察效價變化。

3 結語

（1）首先確定了阿卡波糖標準品濃度在100ug/m1～800ug/ml之間線性良好，可以用外標法來計算發酵上清液的效價。其次，確定了HPLC檢測阿卡波糖發酵上清液時的稀釋倍數為4倍。

（2）考察了阿卡波糖標準品的理化性質，首先是溶解度，在水溶液中溶解度達到714mg/ml時溶液已很粘稠欲接近飽和但仍未飽和。其次是穩定性，第一點是保藏穩定性考察，確定了阿卡波糖標準品在4℃冰箱里保存至四個月時，效價幾乎不變。第二點是穩定pH值范圍，標準品在pH值5.5～6.8的水溶液中比較穩定。第三點是熱穩定性考察，阿卡波糖標準品在酸性pH<4、堿性pH>9時47℃旋轉蒸發不穩定，易分解而導致效價降低，其中酸性條件下比堿性條件下降低得要明顯。第四點是旋光性考察，標準品在p H值為1.5時旋光度比其它pH值時都要大，其它pH值的標準品溶液旋光度基本都一致。

（3）考察了阿卡波糖發酵上清液的理化性質，阿卡波糖發酵上清液在40℃時加熱一小時活性基本無變化，同時確定在水浴47℃40min郵可卡波糖活性物質基本不會損失。保藏穩定性考察確定在一20℃保藏至3個月時效價基本降低一半。確定了效價穩定的pH值范圍在6～7之間。