紫花苜蓿γ－生育酚甲基轉移酶（γ－TMT）基因的克隆與逆境下的表達分析

賈會麗，王學敏，高洪文，董潔，王運琦，劉建寧，石永紅

（1.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西 太原030032；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京100193）

＊維生素E是一種脂溶性維生素，在生物體中具有重要的代謝功能和抗氧化作用［1］。有資料研究表明，維生素E對提高動物的免疫力，改善動物肉質，提高動物繁殖性能，緩解動物應激反應等具有良好的效果［2］。在飼料中添加生育酚，能增加肉品質的穩定性［3］，防止肉類腐敗、變味、變色，并延長上架時間［4，5］；醫學研究證明每天攝入足夠的維生素E會降低一些疾病的發生率，如心血管疾病、癌癥等，還有利于提高機體的免疫力等［6］。γ－生育酚甲基轉移酶（γ－tocopherol methyltransferase）γ－TMT是維生素E合成途徑中一種重要的合成酶，催化γ－生育酚向α－生育酚的轉化，對于改變維生素E組成有重要作用。在擬南芥（Arabidopsisthaliana）葉片和種子中過量表達γ－TMT基因，使維生素E各成分中α－生育酚含量分別提高到90%和95%以上，維生素E活性提高10倍［7，8］。

維生素E還能參與清理植物體內由于逆境脅迫產生的自由基，維持植物體內抗氧化的動態平衡，提高植物的抗逆性［9］。在植物中，α－生育酚定位于質體的內膜、類囊體膜和微粒體膜等膜性結構上，定位和結構上的兩親性特點決定了植物體內維生素E的主要功能與維持光合膜上ROS水平以及減輕膜脂過氧化程度有關［10，11］。據報道，逆境處理下，維生素E生物合成途徑中某些關鍵酶基因的表達會被誘導，且不同的酶基因對不同的脅迫也會出現響應時間以及響應強度的差別［12］。對正常植株進行逆境處理會導致植物體內抗氧化物質的增加，從而提高植株對自由基的清除能力［13］。有研究表明在輪葉黨參（Codonopsislanceolatae）中過量表達γ－TMT基因，能提高轉基因植株的抗氧化活性，且光合速率也比對照提高48%［14］。目前有關維生素E逆境脅迫方面的研究多集中在生育酚環化酶（tocopherol cyclase）TC、尿黑酸異戊烯基轉移酶（homogentisate phytyltransferase）HPT和對羥苯丙酮酸雙加氧酶（4－Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase）HPPD，而對γ－TMT的研究多集中在其生育酚合成方面，對其抗逆性的研究很少［15］。

紫花苜蓿（Medicagosativa）是目前全國乃至世界上種植最多的牧草，營養價值很高［16］，不論青飼、放牧或調制干草［17］，適口性均好，且具有抗寒、耐鹽堿等優良特性［18，19］。因此，研究紫花苜蓿維生素E的合成途徑、克隆相關的酶基因，并通過生物技術方法增強植株的氧化活性、提高維生素E含量，對于提高紫花苜蓿抗逆性，改善其營養品質具有十分重要的意義。本研究從紫花苜蓿中克隆了Ms TMT的全長cDNA序列，對其結構進行分析，并通過模擬不同逆境（NaCl脅迫、PEG脅迫、黑暗脅迫、低溫脅迫以及ABA脅迫），對MsTMT基因的抗逆性進行探討，為進一步研究該基因的抗逆調控機制和紫花苜蓿的生育酚品質改良打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用植物材料紫花苜蓿中苜1號（M.sativacv.Zhongmu No.1）由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所牧草資源研究室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 RNA提取及cDNA的合成 2011年4月1日將中苜1號種子用氯氣消毒24 h后播種于鋪有濾紙的培養皿上，置于25℃光照培養箱內發芽，待長出2片子葉后移至營養缽中（蛭石∶珍珠巖＝3∶1），培養4周取其葉片，用Trizol法提取總RNA，參照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）將RNA反轉錄成cDNA。鹽、干旱和ABA處理時，植株分別用300 mmol／L NaCl、15%PEG和0.1 mmol／L ABA處理0，2，4，8，12和24 h；冷處理時，植株在4℃低溫下脅迫0，2，4，8，12和24 h；暗處理時，植株于黑暗下脅迫0，12，24，48和72 h，Trizol（Ta KaRa公司）法提取各種處理的幼苗葉片RNA，反轉錄成cDNA；組織表達特異性分析時，在同一株紫花苜蓿上分別取根、莖、葉、花和莢果組織，Trizol法提取各組織RNA，反轉錄成cDNA。以上樣品保存于－70℃，用于后續Real－time PCR檢測。

1.2.2 紫花苜蓿γ－TMT基因保守區克隆 根據GenBank登記注冊的已有物種γ－TMT基因cDNA序列，Blast分析后得到其相對保守序列。再以蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）γ－TMT基因cDNA 序列為參照，結合NCBI上的Blast結果，用Primer Primer 5.0軟件設計保守區特異性引物P1和P2（表1），以cDNA為模板進行PCR擴增，反應條件如下：94℃預變性5 min，94℃30 s，57℃30 s，72℃1 min，共35個循環，反應結束后72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用DNA Gel Extract Kit（Fermentas公司，K0513）回收PCR產物，將回收片段連接PMD－18T載體（Ta KaRa公司，D101A），重組質粒轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞（天根生化科技有限公司，CB101－01），挑選陽性克隆送至上海英駿生物技術有限公司測序。

表1 試驗中所用到的引物序列Table 1 Sequence of primers used in the experiment

1.2.3 紫花苜蓿γ－TMT基因3′末端和5′末端cDNA片段的克隆 根據已獲得的紫花苜蓿γ－TMTcDNA保守區序列，設計3′RACE特異性引物P3（表1）和5′RACE特異性引物P4（表1），按照SMARTTMRACE c DNA Amplification Kit（Clontech公司）的方法進行反轉錄反應和PCR擴增。反應條件如下：94℃預變性3 min；94℃30 s，72℃3 min，5個循環；94℃30 s，70℃30 s，72℃2 min，5個循環；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25個循環；反應結束后72℃延伸5 min。將擴增產物測序，進行序列拼接，得到紫花苜蓿γ－TMT基因的全長序列。用DNAMAN 6.0軟件預測其可能的開放閱讀框（ORF），設計合成1對cDNA全長引物P5、P6（表1），進行PCR擴增，將擴增產物測序后得到紫花苜蓿γ－TMT基因ORF序列。

1.2.4 Real－time PCR檢測紫花苜蓿γ－TMT基因組織及逆境脅迫表達特異性 參照SYBR Premix Ex Taq（Ta KaRa公司，DRR041A）的引物設計原則，根據得到的紫花苜蓿ORF序列設計Real－time PCR特異性引物P7、P8（表1），預計片段大小為151 bp。選擇Actin基因為內參基因，用7500熒光定量PCR儀（ABI公司）進行PCR擴增，每個反應重復3次，采用2步法，條件如下：第1步，95℃預變性2 min，第2步，95℃5 s，60℃34 s，40個循環。反應結束后，根據得到的周期閾值（cycle threshold），利用2－△△Ct方法［20］，分別計算紫花苜蓿γ－TMT基因在根、莖、葉、花、莢果中的表達量以及各逆境脅迫下的表達量。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿γ－TMT基因的克隆

根據NCBI上的Blast結果，用Primer Primer 5.0軟件設計特異引物P1、P2，以紫花苜蓿cDNA為模板，擴增得到404 bp的目的片段（圖1）。經Blast比對分析，發現此片段與已報道的γ－TMT基因有較高的相似性，其中與截形苜蓿的γ－TMT基因cDNA序列同源性最高，為97%，初步確定獲得的cDNA片段是紫花苜蓿γ－TMT基因的部分片段。

根據得到的保守區序列設計3′、5′RACE特異性引物，采用RACE技術結合PCR的方法，擴增出γ－TMT基因的3′RACE和5′RACE末端序列，測序結果顯示3′和5′端的片段長度分別為660和743 bp（圖2）。用DNAMAN 6.0軟件進行拼接，得到總長度為1 306 bp的全長c DNA序列。以紫花苜蓿cDNA為模板，用引物P5、P6擴增得到939 bp的開放閱讀框（ORF）（圖3），該ORF序列與拼接獲得的ORF序列完全一致。

圖1 紫花苜蓿γ－TMT基因保守區擴增結果Fig.1 Electrophoresis result of conservative fragment

圖2 紫花苜蓿γ－TMT基因3′RACE和5′RACE電泳結果Fig.2 Electrophoresis result of the 3′RACE and 5′RACE fragments

2.2 紫花苜蓿γ－TMT基因的生物信息學分析

利用DNAStar軟件對紫花苜蓿γ－TMT基因cDNA序列進行分析，該基因全長1 306 bp，包含有一個939 bp完整的開放閱讀框，編碼312個氨基酸，命名為Ms TMT。氨基酸序列分析表明，Ms TMT基因編碼蛋白分子質量約為34.5 k Da，理論等電點PI為5.62。總共包括4 842個原子。在組成該酶的20種氨基酸中，堿性氨基酸（K、R）34個，酸性氨基酸（D、E）40個，疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V）118個，極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）66個。

通過在線軟件http：／／prosite.expasy.org／cgi－bin／prosite／對Ms TMT進行功能位點預測，發現該基因有1個腺苷脫氨基酶信號（［SA］－［LIVM］－［NGS］－［STA］－D－D－P）。利用NCBI的Blast P在蛋白保守區數據庫對Ms TMT進行蛋白保守區預測，結果顯示Ms TMT屬于甲基轉移酶家族（Ado Met－MTases）（圖4）。該蛋白還包含有2個S－腺苷甲硫氨酸的結合結構域（XXDXGCGIG，VXXPGGXXIX）（圖5），與大豆（Glycinemax）、陸地棉（Gossypiumhirsutum）等其他物種的γ－TMT結構相似［6，21，22］，表明該基因確實是紫花苜蓿γ－TMT基因。

從GenBank中下載其他1 3種植物γ－TMT蛋白序列，涉及到豆科、禾本科、十字花科、茄科等多個物種。用MEGA 4.0軟件構建系統進化樹，分析結果顯示，不同來源的γ－TMT基因聚為3類。紫花苜蓿γ－TMT與豆科植物蒺藜苜蓿γ－TMT親緣關系最近，其次是大豆（圖6）。用DNAMAN 6.0軟件對紫花苜蓿γ－TMT蛋白與大豆、蒺藜苜蓿、水稻（Oryzasativa）、擬南芥等13種植物中的γ－TMT蛋白同源性進行比較，結果顯示與上述幾種模式植物的同源性分別為58.19%，54.87%，51.07%和50.12%。γ－TMT蛋白在序列上的差異主要體現在蛋白質的N端，中部的功能區則比較保守。說明雖然不同生物之間的γ－TMT序列同源性有一定差異，卻具有功能上的保守性，推測有可能形成類似的蛋白質三維結構。

圖3 紫花苜蓿γ－TMT基因ORF擴增結果Fig.3 Electrophoresis result of the ORF

2.3 MsTMT基因在不同組織的表達特異性

在同一株紫花苜蓿上分別取根、莖、葉、花以及莢果，Real－time PCR分析各組織的相對表達量，結果表明，以花中Ms TMT基因的表達量為對照，葉片中表達量最高，為對照的218倍，且明顯高于其他組織，莖中表達量次之，為對照的44倍，根中表達量為對照的12.8倍，莢果中表達量為對照的11.8倍（圖7）。說明該基因在紫花苜蓿各個器官中均有表達，且在含有光合器官的綠色組織中表達量最高。一般認為植物細胞中α－生育酚的合成部位在綠色植物細胞所特有的質體中［23］。葉綠體含有葉綠素，是重要的質體，主要存在于植物體綠色部分的薄壁組織細胞中，是綠色植物進行光合作用的場所。實驗結果說明該基因的表達與質體的分布有很強的相關性。

圖4 MsTMT蛋白序列Blast分析Fig.4 The Blast analysis result of MsTMT protein

2.4 不同逆境脅迫處理下Ms TMT基因表達分析

2.4.1 鹽脅迫下Ms TMT基因表達特性 以處理0 h為對照，分析NaCl處理不同時間Ms TMT基因的表達差異。結果表明，MsTMT基因受NaCl誘導表達上調，脅迫處理2 h后該基因的表達就已經開始上調，至8 h之前表達量上調不明顯，僅為對照的2.1～2.4倍，8 h后基因表達量迅速上升，24 h后該基因的表達量達到對照的21.4倍（圖8）。

2.4.2 PEG脅迫下Ms TMT基因表達特性 以處理0 h為對照，分析PEG模擬干旱處理不同時間Ms TMT基因的表達差異。結果表明，隨PEG誘導時間的變化，MsTMT基因表達呈明顯單峰趨勢，在4 h表達量最高，為對照的4.3倍（圖9）。

2.4.3 黑暗脅迫下Ms TMT基因表達特性 以處理0 h為對照，分析黑暗脅迫不同時間Ms TMT基因的表達差異。結果表明，隨脅迫時間的延長，Ms TMT基因的表達量出現先下降后上升趨勢。黑暗脅迫24 hMs TMT表達量最低，僅為對照的9%，隨后基因的表達量迅速上升，72 h基因的表達量為對照的12.3倍（圖10）。

2.4.4 低溫脅迫下MsTMT基因表達特性 以處理0 h為對照，分析低溫脅迫不同時間MsTMT基因的表達差異。結果表明，低溫脅迫后，Ms TMT基因表達量均低于對照（圖11）。

圖5 MsTMT基因全長核苷酸序列及推測的氨基酸序列Fig.5 Nucleotide sequence and its deduced amino acid sequence of MsTMT gene

2.4.5 ABA脅迫下MsTMT基因表達特性 以處理0 h為對照，分析外源ABA處理不同時間MsTMT基因的表達差異。結果表明，受ABA誘導后該基因的表達量沒有明顯變化（圖12），說明該基因表達不受外源ABA誘導。

3 討論

本研究得到紫花苜蓿MsTMT基因的全長cDNA序列。對MsTMT氨基酸序列分析后發現該蛋白有一個腺苷脫氨基酶信號（SLSTDDP），屬于甲基轉移酶家族（Ado Met－MTases），包含有2個保守的S－腺苷甲硫氨酸結合結構域（SAM－domain）XXDXGCGIG、VXXPGGXXIX，這與已知的棉花（Gossypiumspp.）、大豆等的γ－TMT結構特點一致［6，22，23］。

圖6 MsTMT蛋白與其他13種γ－TMT蛋白的系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree ofγ－TMT protein and other thirteen proteins

圖7 MsTMT基因的組織表達特異性Fig.7 Organ－specific expression pattern of the MsTMT gene

圖8 MsTMT基因在NaCl脅迫下的表達模式分析Fig.8 Expression pattern of MsTMT in response to NaCl stress

圖9 MsTMT基因在PEG脅迫下的表達模式Fig.9 Expression pattern of MsTMT in response to PEG stress

圖10 MsTMT基因在黑暗脅迫下的表達模式Fig.10 Expression pattern of MsTMT in response to dark stress

圖11 MsTMT基因在4℃低溫脅迫下的表達模式Fig.11 Expression pattern of MsTMT in response to low temperature stress

圖12 MsTMT基因在ABA處理下的表達模式Fig.12 Expression pattern of MsTMT in response to ABA treatment

本研究利用Real－time PCR方法檢測了MsTMT基因在紫花苜蓿中的組織表達特異性，結果發現MsTMT基因在各器官中均有表達，但各器官的表達峰度不同，葉片中表達量最高。歐陽青等［24］研究了Bo TMT在結球甘藍（Brassicaoleraceavar.capitata）不同器官中的表達特征，結果發現Bo TMT在結球甘藍的各器官中均有表達，但在花和葉片中的表達量明顯高于根、莖和種子。一般認為植物細胞中α－生育酚的生物合成部位是質體，主要存在于植物體綠色部分的薄壁組織細胞中，是綠色植物進行光合作用的主要場所。在植物的有色組織（如綠色的葉片）中，α－生育酚是含量最高的生育酚類型，而在非綠色組織（如根、種子）中，α－生育酚含量很低，絕大部分為其生物合成前體γ－生育酚［25］。γ－TMT的作用是催化γ－生育酚轉化為α－生育酚，有研究表明在γ－TMT缺失的突變型擬南芥葉片中，γ－生育酚含量顯著提高，而α－生育酚消失，重新導入γ－TMT后，葉片又可合成α－生育酚［21］。本實驗結果表明MsTMT基因的表達與質體的分布有很強的相關性。

維生素E中由于有酚基的存在，使其具有較強的抗氧化作用，可以保護蛋白質不受到光合損傷，避免膜結構發生脂類過氧化。當植物受到諸如強光、干旱、高鹽和極端溫度等逆境脅迫后，體內的活性氧（ROS）會增加，ROS的積累會誘導抗氧化物質相關基因的表達。對正常植株進行逆境處理，會導致植物體內抗氧化物質的增加，從而提高植株對自由基的清除能力［12，13］。據報道，在逆境脅迫下，維生素E生物合成途徑中的某些關鍵酶基因的表達會被誘導，如經由強光處理，擬南芥hppd和hpt均會出現表達上調，而tc突變株并沒有出現上調，γ－TMT基因表達量幾乎沒有變化［12］。Abbasi等［26］通過RNAi干擾技術分別構建了抑制煙草（Nicotianatabacum）hpt和γ－TMT基因表達的株系，分別用NaCl和山梨醇模擬鹽脅迫和滲透脅迫逆境，研究轉基因煙草對逆境處理的耐受性，結果表明，hpt基因被抑制的株系對2種逆境的耐受性明顯下降，但是γ－TMT基因被抑制的株系會增強對山梨醇滲透逆境的抗性，卻缺乏了對鹽的耐受性。說明生育酚的總量及組成不同所產生的抗逆性及抗逆機理也不盡相同。本研究通過模擬不同逆境（NaCl脅迫、PEG脅迫、黑暗脅迫、低溫脅迫以及ABA脅迫），對MsTMT基因的抗逆性進行探討。發現Ms TMT基因受NaCl脅迫、PEG脅迫以及黑暗脅迫表達量上調，但各脅迫下MsTMT基因表達上調趨勢不同，這可能是由這3種逆境的不同脅迫機制所造成。

光合激素，如甲基茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA），同樣可以影響維生素E的生物合成。維生素E合成途徑相關的基因，如hppd，啟動子區具有ABA反應元件。逆境誘導JA積累能夠抑制光合作用，但活化了抗氧化物質合成的基因。有研究報道在抗旱植物中，內源SA與α－生育酚含量之間存在著相關性。抗氧化物質（維生素E）的水平，體現了植物對外界環境和內環境的應激能力［14］。說明維生素E既可以起到抗氧化作用，也可以作為一種信號，傳遞氧化還原的狀態。本研究對紫花苜蓿進行外源ABA處理后，發現外源ABA基本不影響該基因的表達，這可能與Ms TMT啟動子區域的響應元件有一定關系。或許其他光合激素如JA、SA會對MsTMT的表達產生影響，還需要進一步的證實。

γ－TMT是維生素E合成途徑中最后一步的關鍵酶，催化γ－生育酚向α－生育酚的轉化，對于改變維生素E組成有重要作用。通過過量表達γ－TMT基因來提高植物體內α－生育酚的比例已經涉及到多個物種［11，27］，但在栽培利用面積最廣泛的紫花苜蓿上的研究幾乎沒有，且對γ－TMT的研究多集中在其生育酚合成方面，對其抗逆性的研究很少，本試驗將繼續構建植物增強表達載體，進行Ms TMT基因功能研究，進一步為改善紫花苜蓿的品質和抗性創造條件。

［1］ 潘衛東，李曉峰，陳雙燕，等.植物維生素E合成相關酶基因的克隆及其在體內功能研究進展［J］.植物學通報，2006，23（1）：68－77.

［2］ 王改琴，李維，王恬.維生素E對家禽抗氧化、免疫功能和繁殖性能的影響研究進展［J］.家畜生態學報，2009，30（6）：1－5.

［3］ 王軍，田玉民，劉璐.維生素E對畜禽肉色穩定性影響的研究進展［J］.安徽農業科學，2008，（33）：14545－14547.

［4］ 胡英考.植物維生素E合成及其生物技術改良［J］.中國生物工程雜志，2004，24（1）：32－35.

［5］ 何河，方熱軍.日糧中添加維生素E對牛肉品質的影響［J］.飼料博覽，2008，（2）：13－16.

［6］ Shintani D，DellaPenna D.Elevating the Vitamin E content of plants through metabolic engineering［J］.Science，1998，282（11）：2098－2100.

［7］ Cho E A，Lee C A，Kim Y S，etal.Expression of gamma－tocopherol methyltransferase transgene improves tocopherol composition in lettuce（LatucasativaL.）［J］.Molecules and Cells，2005，19（1）：16－22.

［8］ Van Eenennaam A L，Lincoln K，Durrett T P，etal.Engineering vitamin E content：fromArabidopsismutant to soy oil［J］.The Plant Cell，2003，15（12）：3007－3019.

［9］ 張一弓，張麗靜，傅華.植物維生素E合成酶基因克隆及其逆境生理研究進展［J］.草業學報，2009，18（5）：235－242.

［10］ Munné－Bosch S.The role ofα－tocopherol in plant stress tolerance［J］.Journal of Plant Physiology，2005，162（7）：743－748.

［11］ Vidi P A，Kanwischer M，Baginsky S，etal.Tocopherol cyclase（VTE1）localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles［J］.The Journal of Biological Chemistry，2006，281（16）：11225－11234.

［12］ Collakova E，DellaPenna D.The role of homogentisate phytyltransferase and other tocopherol pathway enzymes in the regulation of tocopherol synthesis during abiotic stress［J］.Plant physiology，2003，133（10）：930－940.

［13］ Noctor G，Foyer C H.Ascorbate and glutathione：keeping active oxygen under control［J］.Plant Biology，1998，49（6）：249－279.

［14］ Ghimire B K，Seong E S，Goh E J，etal.Improving antioxidant activity in transgenicCodonopsislanceolataplants via overexpression of theγ－tocopherol methyltransferase（γ－TMT）gene［J］.Plant Growth Regulation，2011，63（1）：1－6.

［15］ 李殷.植物維生素E生物合成途徑及調控［D］.上海：復旦大學，2009.

［16］ 張冬玲，劉建寧，王運琦，等.山西省中部地區紫花苜蓿引種試驗［J］.中國草食動物，2010，30（5）：43－46.

［17］ 夏銀素，王成章，詹發柏，等.苜蓿草粉飼糧添加纖維素酶對蛋雞生產性能、蛋品質及養分利用率的影響［J］.草業學報，2011，20（5）：183－191.

［18］ 李源，劉貴波，高洪文，等.紫花苜蓿種質耐鹽性綜合評價及鹽脅迫下的生理反應［J］.草業學報，2010，19（4）：79－86.

［19］ 姜健，楊寶靈，夏彤，等.紫花苜蓿耐鹽種質資源的遺傳多樣性分析［J］.草業學報，2011，20（1）：119－125.

［20］ Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real－time quantitative PCR and the 2－△△CTmethod［J］.Methods，2001，25（4）：402－408.

［21］ Bergmüller E，Porfirova S，Drmann P.Characterization of anArabidopsismutant deficient inγ－tocopherol methyltransferase［J］.Plant Molecular Biology，2003，52（8）：1181－1190.

［22］ 胡英考，孟憲萍，李雅軒，等.大豆γ－生育酚甲基轉移酶基因的克隆與表達分析［J］.大豆科學，2011，30（2）：198－204.

［23］ 鄒禮平，高和平.棉花γ－生育酚甲基轉移酶基因全長cDNA的克隆與序列分析［J］.江蘇農業學報，2009，25（3）：490－493.

［24］ 歐陽青，樊春濤，孫卉，等.結球甘藍γ－生育酚甲基轉移酶cDNA的克隆、分析及其異源表達酶蛋白的功能研究［J］.自然科學進展，2003，13（7）：709－715.

［25］ Grusak M A.Improving the nutrient composition of plants to enhance human nutrition and health［J］.Plant Biology，1999，50（6）：133－161.

［26］ Abbasi A R，Hajirezaei M，Hofius D，etal．Specific roles ofα－andγ－tocopherol in abiotic stress responses of transgenic tobacco［J］．Plant physiology，2007，143（4）：1720－1738．

［27］ Lee B K，Kim S L，Kim K H，etal．Seed specific expression of perillaγ－tocopherol methyltransferase gene increases a－tocopherol content in transgenic perilla（Perillafrutescens）［J］．Plant Cell Tissue and Organ Culture，2008，92（1）：47－54．