羊草DREB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育和功能研究

馬興勇，彭獻(xiàn)軍，蘇蔓，張樂(lè)新，周慶源，陳雙燕，程麗琴＊，劉公社＊

（1.中國(guó)科學(xué)院植物研究所資源植物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100093；2.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100049）

＊干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，植物中相應(yīng)發(fā)生一系列分子水平的變化來(lái)適應(yīng)脅迫［1］。轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控逆境相關(guān)基因在特異時(shí)空內(nèi)表達(dá)，是植物響應(yīng)逆境的一個(gè)重要組成部分［2］。DREB（dehydration responsive element binding proteins）是植物中已知的與非生物脅迫相關(guān)的最重要的轉(zhuǎn)錄因子基因之一［1］。DREB轉(zhuǎn)錄因子分為DREB1和DREB2兩類(lèi)，分別在植物響應(yīng)低溫脅迫和滲透脅迫的過(guò)程中起作用［3］。DREB轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與啟動(dòng)子上的DRE／CRT元件結(jié)合，激活下游一系列與非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)［1］。基因芯片分析表明，兩類(lèi)DREB轉(zhuǎn)錄因子的下游基因有重疊的部分但并不完全相同［4］。DREB2類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子除了響應(yīng)滲透脅迫外，也響應(yīng)高溫脅迫。另外，有些DREB轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)受放牧［5］或創(chuàng)傷的誘導(dǎo)［6］。擬南芥（Arabidopsisthaliana）［3］、水稻（Oryzasativa）［7］和玉米（Zeamays）［8］等植物中克隆到的 DREB轉(zhuǎn)錄因子，已被證明可以用來(lái)提高植物的抗逆能力。許多研究者已經(jīng)將該類(lèi)基因轉(zhuǎn)化到各種草坪草及牧草之中，并成功獲得了綜合抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株［9］。

羊草（Leymuschinensis）隸屬禾本科（Gramineae）賴(lài)草屬，在我國(guó)東北和內(nèi)蒙古有廣泛分布［10］。羊草兼具重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值，是一種非常重要的鄉(xiāng)土草。羊草具有發(fā)達(dá)的根莖，可以通過(guò)根莖進(jìn)行無(wú)性繁殖［11］。羊草具有耐寒和耐鹽堿的特點(diǎn)，對(duì)NaCl、Na2CO3處理的最高耐受濃度可分別達(dá)到600和175 mmol／L［12］。雖然羊草具有很好的抗逆能力，但是關(guān)于其抗逆分子機(jī)理的研究較少。目前，羊草中僅有幾丁質(zhì)酶ClassⅡ、乙醛脫氫酶、光系統(tǒng)Ⅱ外周蛋白和V－ATPase等少數(shù)基因被克隆［13－17］。作者所在的實(shí)驗(yàn)室也成功地克隆并鑒定了羊草中的1個(gè)DREB轉(zhuǎn)錄因子基因［5］。目前羊草的基因組信息相對(duì)較少，這限制了羊草抗逆分子機(jī)理的研究和相關(guān)基因的克隆。通過(guò)構(gòu)建c DNA文庫(kù)并對(duì)部分cDNA克隆測(cè)序來(lái)獲得ESTs，是獲得基因組信息的有效方法［18］。Jin等［19］構(gòu)建了堿性環(huán)境脅迫下羊草葉和根的cDNA文庫(kù)，并測(cè)序得到了1 228條ESTs。王麗娟等［20］通過(guò)構(gòu)建羊草葉片c DNA文庫(kù)并測(cè)序得到了285條ESTs。然而，通過(guò)這種方法獲得的ESTs數(shù)量仍然是有限的。目前，GenBank的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)（nucleotide database）中僅有羊草序列72條，EST數(shù)據(jù)庫(kù)（dbEST）中僅有羊草序列1 692條，2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共有2條DREB序列。DREB轉(zhuǎn)錄因子屬于ERF家族中的DREB亞家族，在擬南芥基因組中該亞家族有57個(gè)成員。據(jù)此，羊草DREB亞家族基因序列尚有潛力可挖。作者所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)羊草轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了高通量測(cè)序，獲得了大量EST。本研究通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)EST數(shù)據(jù)中的DREB轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行系統(tǒng)挖掘，并選擇其中的Lc DREB21基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

羊草和擬南芥，2010年種植于中國(guó)科學(xué)院植物研究所培養(yǎng)室，恒溫23℃，16 h光照，8 h黑暗。

1.2 方法

1.2.1 高通量測(cè)序 羊草種植在塑料缽中，8周大的幼苗（4葉期）用于實(shí)驗(yàn)。幼苗經(jīng)低溫和干旱處理，取樣，混合后提取RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，建庫(kù)，使用454 GS FLX進(jìn)行測(cè)序（測(cè)序工作由中國(guó)科學(xué)院國(guó)家基因研究中心完成）。測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)GoPipe進(jìn)行GO（gene ontology）分析，通過(guò)NCBI的blast進(jìn)行核酸和蛋白的同源性分析，通過(guò)與CDD數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行KOG（clusters of eukaryotic orthologous groups）分析。

1.2.2 RACE 羊草幼苗經(jīng)400 mmol／L NaCl處理，提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板。采用Clontech公司的RACE試劑盒。Lc DREB21基因引物和UPM引物序列分別為：5′－TGAAGTTATCCCTATTGCTCCGCATGAC－3′；5′－CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT－3′。

1.2.3 熒光定量PCR 對(duì)于鹽脅迫，將羊草幼苗根部浸入400 mmol／L NaCl溶液，干旱脅迫用20%PEG6000模擬，ABA處理使用濃度為100μmol／L，低溫處理將羊草苗放進(jìn)4℃冰箱。4種處理后，分別在0，1，3，8，12和24 h時(shí)取材，提取RNA。經(jīng)DNase I消化的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用兩步法進(jìn)行熒光定量PCR。基因特異引物：5′－TAAACCCGTCATCGCCATCT－3′，5′－CCTGGAAGTATCCCAACCAAA－3′；內(nèi)參（actin）引物：5′－CTGTTCTTGGCAGTCTCCAGCTC－3′，5′－GTGCTTTCCCTCTATGCAAGTGGT－3′。

1.2.4 酵母單雜交Lc DREB21基因經(jīng)Sal I和Pst I酶切后，連接到酵母表達(dá)載體p Bridge的Sal I和Pst I酶切位點(diǎn)間，得到重組載體pBridge－BD－Lc DREB21。重組載體pBridge－BD－Lc DREB21轉(zhuǎn)化含有His3和LacZ報(bào)道基因的酵母AH109株系。用pBridge空載體轉(zhuǎn)化酵母AH109株系作為負(fù)對(duì)照，用轉(zhuǎn)有BD－Lc DREB3a的AH109株系作為陽(yáng)性對(duì)照。轉(zhuǎn)化方法參照Clontech試劑盒的酵母轉(zhuǎn)化方法。將上述3個(gè)轉(zhuǎn)化酵母菌株在不含His和Trp的SD培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d的酵母用于含有X－gal的Z－buffer顯色。

1.2.5 擬南芥轉(zhuǎn)化及篩選 利用pCAMBIA1302的NcoI和SpeI位點(diǎn)，構(gòu)建了pCAMBIA1302－35S：：LcDREB21－GFP。將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥［21］。使用含25 mg／L潮霉素的MS培養(yǎng)基，篩選得到35S：：Lc DREB21－GFP陽(yáng)性擬南芥株系。

1.2.6 熒光觀察 取在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4 d的35S：：Lc DREB21－GFP T1代陽(yáng)性植株，壓片，使用ZEISS LSM 510 META激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 通過(guò)blast分析，篩選羊草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中的ERF家族基因，結(jié)合擬南芥ERF家族基因的蛋白序列構(gòu)建了鄰接樹(shù)（neighbor－joining tree）。參考已有的研究，鑒定了羊草DREB轉(zhuǎn)錄因子基因所在的分支。利用羊草和擬南芥中DREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列再次構(gòu)建鄰接樹(shù)。序列比對(duì)使用MUSCLE［22］，比對(duì)后的序列用Bio Edit進(jìn)行編輯［23］。使用MEGA5構(gòu)建鄰接樹(shù)，設(shè)置bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000［24］。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊草DREB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育研究

通過(guò)Roche 454測(cè)序技術(shù)，作者所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)羊草轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序。經(jīng)過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)分析，得到屬于羊草DREB轉(zhuǎn)錄因子亞家族的EST 26條。采用鄰接法，利用羊草EST和擬南芥基因組中的DREB亞家族基因的蛋白序列，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。參照已有的研究，將羊草DREB亞家族EST分為4個(gè)類(lèi)群［25］（圖1）。羊草DREB轉(zhuǎn)錄因子在4個(gè)類(lèi)群有較均勻地分布，這說(shuō)明DREB轉(zhuǎn)錄因子亞家族在羊草和擬南芥基因組中是保守的。同時(shí)也表明，本測(cè)序數(shù)據(jù)覆蓋度好，拼接準(zhǔn)確。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，DREB1／CBF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子位于第3類(lèi)群，DREB2類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子位于第4類(lèi)群。DREB1／CBF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子和DREB2類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子分別在植物耐低溫和耐滲透脅迫中起作用。目前，對(duì)位于第1類(lèi)群基因功能的研究較少，第2類(lèi)群基因的功能還不清楚。

在擬南芥中，DREB2A（At5g05410）基因受干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá)后可以提高擬南芥耐干旱和高鹽脅迫的能力［26］。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，與At5g50410同源性最高的是Lc DREB21，它們都位于第4類(lèi)群。通過(guò)RACE得到了Lc DREB21的編碼區(qū)全長(zhǎng)，并對(duì)其功能進(jìn)行了深入研究。

圖1 羊草和擬南芥DREB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of DREB transcription factors in L.chinensis ESTs and A.thaliana genome

2.2 Lc DREB21編碼區(qū)全長(zhǎng)的獲得

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到的Lc DREB21 EST長(zhǎng)度為486 bp。通過(guò)NCBI中的blast分析，其與大麥（Hordeum vulgare）和小麥（Triticumaestivum）的DREB基因具有很高同源性，可能包括CDS 3′末端。根據(jù)Lc DREB21 3′端序列，設(shè)計(jì)了5′引物進(jìn)行RACE，得到了900 bp左右的特異性擴(kuò)增片段（圖2）。PCR產(chǎn)物回收并測(cè)序，得到的5′序列與原序列拼接得到總長(zhǎng)為949 bp的序列。用DNAMAN軟件對(duì)得到的序列進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)，并與大麥同源基因比較，結(jié)果表明其具有完整的CDS（GenBank登入號(hào)為：JN860437）。LcDREB21編碼1個(gè)由278個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白。利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)工具對(duì)其進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示其第76～139位氨基酸殘基構(gòu)成一個(gè)典型的AP2保守結(jié)構(gòu)域。

2.3 Lc DREB21在脅迫條件下的表達(dá)模式

對(duì)羊草幼苗分別進(jìn)行PEG、ABA、NaCl和低溫處理，在0，1，3，8，12和24 h等6個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取材，用于熒光定量PCR分析（圖3）。結(jié)果表明，Lc DREB21表達(dá)受PEG、ABA和NaCl的誘導(dǎo)，3種處理下，mRNA的積累量分別在24，12和3 h達(dá)到高峰。另外，Lc DREB21的表達(dá)基本不受低溫誘導(dǎo)。

2.4 Lc DREB21的轉(zhuǎn)錄激活功能

一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子起作用需要結(jié)合特定的啟動(dòng)子，并激活或抑制下游基因的表達(dá)。使用酵母單雜交系統(tǒng)，證明了Lc DREB21具有激活功能。首先，將Lc DREB21克隆到pBridge載體上，并轉(zhuǎn)化酵母AH109。得到的陽(yáng)性酵母菌株能夠在不含His和Trp的SD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。而且，陽(yáng)性菌株在劃線培養(yǎng)后，經(jīng)含有X－gal的Z－buffer顯色后變藍(lán)。轉(zhuǎn)BD－Lc DREB3aAH109株系作為陽(yáng)性對(duì)照得到了類(lèi)似結(jié)果［5］。而轉(zhuǎn)有p Bridge空載體的AH109作為陰性對(duì)照，不能在缺少His和Trp的SD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。以上結(jié)果說(shuō)明，Lc DREB21具有轉(zhuǎn)錄激活能力（圖4）。然而與對(duì)照相比，Lc DREB21的激活能力明顯較弱。

圖2 LcDREB21的5′RACE擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplified results of LcDREB21 by 5′RACE.

圖3 脅迫和ABA處理下LcDREB21的表達(dá)模式Fig.3 Expression patterns of LcDREB21 in response to various treatments

2.5 Lc DREB21的亞細(xì)胞定位

通過(guò)潮霉素篩選，得到了T1代轉(zhuǎn)35S：：Lc DREB21－GFP和35S：：GFP的擬南芥陽(yáng)性苗。轉(zhuǎn)基因擬南芥苗經(jīng)壓片后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。在轉(zhuǎn)35S：：GFP的擬南芥中，綠色熒光在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布。在轉(zhuǎn)35S：：Lc DREB21－GFP的擬南芥中，綠色熒光只分布在細(xì)胞核中。以上結(jié)果表明，Lc DREB21專(zhuān)一性定位在細(xì)胞核中（圖5）。

圖4 酵母單雜交Fig.4 One hybrid system of yeast

圖5 LcDREB21亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular location of LcDREB21

3 討論

對(duì)擬南芥和水稻基因組中DREB的系統(tǒng)發(fā)育研究表明，DREB轉(zhuǎn)錄因子亞家族的多數(shù)類(lèi)群在2種植物中同時(shí)存在，在進(jìn)化上是保守的［25］。所以新測(cè)序物種DREB轉(zhuǎn)錄因子的分析，可以參照擬南芥和水稻中的研究，如在小麥［27］和玉米［28］研究中的應(yīng)用。本研究共得到26條DREB轉(zhuǎn)錄因子EST，參照擬南芥中DREB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育研究，將羊草DREB亞家族EST分為4個(gè)類(lèi)群［25］。其中位于第一和第二類(lèi)群的共有11條，在擬南芥和水稻中，對(duì)DREB亞家族這2個(gè)類(lèi)群中基因的研究較少，它們的功能還不清楚［25］。DREB1類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子和DREB2類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子分別位于第3和第4類(lèi)群，Lc DREB21位于第四類(lèi)群，屬于DREB2類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。多數(shù)DREB2類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo)，如AtDREB2A、AtDREB2B和OsDREB2A等［3，7，29］。然而，OsDREB2B和ZmDREB2A的表達(dá)響應(yīng)干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo)的同時(shí)，也受低溫脅迫的誘導(dǎo)［8，29］。與多數(shù)DREB轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)似，Lc DREB21的表達(dá)受干旱和高鹽脅迫的誘導(dǎo)，基本不受冷誘導(dǎo)。另外，LcDREB21具有轉(zhuǎn)錄激活功能和核定位能力。因此，LcDREB21很可能在植物應(yīng)對(duì)干旱和高鹽脅迫的過(guò)程中起作用。

在擬南芥、水稻和玉米等植物中已克隆得到了多個(gè)DREB轉(zhuǎn)錄因子基因，然而牧草中的研究還比較少［9］。基因組信息的匱乏，限制了羊草DREB轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆和功能研究。本研究發(fā)掘的26條DREB轉(zhuǎn)錄因子EST，豐富了羊草原來(lái)僅有2條DREB的核酸和EST數(shù)據(jù)庫(kù)，為進(jìn)一步研究DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物耐低溫和滲透脅迫過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。另外，有些DREB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受刈割或創(chuàng)傷的誘導(dǎo)，如Peng等［5］報(bào)道了Lc DREB3a的表達(dá)受刈割的誘導(dǎo)，Hong和Kim［6］報(bào)道了Ca DREBLP1的表達(dá)受創(chuàng)傷的誘導(dǎo)。對(duì)Lc DREB21在刈割下的表達(dá)進(jìn)行了半定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量沒(méi)有明顯變化（結(jié)果未列出）。因此，羊草DREB家族亞家族基因中有的與創(chuàng)傷或刈割有關(guān)，有的未必有關(guān)，這方面的研究有助于理解羊草耐牧的分子機(jī)理。

基因工程在最近20年取得了迅猛發(fā)展，具有在分子水平上定向改造遺傳性狀的優(yōu)勢(shì)，在牧草新品種培育研究中的應(yīng)用也越來(lái)越廣［30］。一些基因已被用于基因工程改良羊草，如 Wang等［31］通過(guò)組成型表達(dá)Ta LEA3基因，提高了羊草的耐旱能力。與單個(gè)功能基因相比，通過(guò)轉(zhuǎn)化DREB轉(zhuǎn)錄因子基因，可以激活下游一系列抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，從而能提高植物的綜合抗性。因此，羊草DREB轉(zhuǎn)錄因子用于基因工程改良是非常好的選擇。

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