苜蓿乙烯應(yīng)答因子基因的表達(dá)特性和生物信息學(xué)分析

陳婷婷，楊青川，張新全，康俊梅，丁旺，張鐵軍

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川 雅安625014）

＊AP2／ERF轉(zhuǎn)錄因子包含AP2結(jié)構(gòu)域，最早從擬南芥（Arabidopsisthaliana）中分離得到。AP2結(jié)構(gòu)域由高度保守的57～70個(gè)氨基酸殘基組成，包含YRG區(qū)和RAYD區(qū)，YRG區(qū)的N－端由富含20個(gè)氨基酸殘基的堿性和親水性區(qū)域組成，對(duì)識(shí)別各類(lèi)順式作用元件并與之相互結(jié)合起關(guān)鍵作用；RAYD區(qū)位于AP2／ERF結(jié)構(gòu)域的C－端，約含有40個(gè)氨基酸殘基，其中約18個(gè)氨基酸殘基組成的核心區(qū)可形成雙親性的α－螺旋。DNA結(jié)合區(qū)與DNA的結(jié)合依賴(lài)于YRG區(qū)，RAYD區(qū)通過(guò)影響YRG區(qū)的構(gòu)象或與其他蛋白發(fā)生相互作用調(diào)節(jié)AP2結(jié)構(gòu)域與DNA的結(jié)合［1，2］。根據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域的數(shù)量可以將 AP2／ERF轉(zhuǎn)錄因子分為3個(gè)家族［3］，分別為 AP2、ERF和RAV家族。AP2家族包含2個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，主要調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育；RAV家族包含1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域和1個(gè)B3結(jié)構(gòu)域；ERF家族蛋白只包含1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，又可分為2個(gè)亞家族：CBF／DREB亞家族和ERF亞家族，CBF／DREB在植物應(yīng)答非生物脅迫的過(guò)程中發(fā)揮重要作用［4－6］，ERF亞家族主要參與生物脅迫應(yīng)答［7］，許多研究表明ERF亞家族成員同時(shí)也參與非生物脅迫應(yīng)答。苜蓿（Medicagosativa）是一種優(yōu)質(zhì)的豆科牧草［8，9］，研究其乙烯應(yīng)答因子具有重要意義。本研究以擬南芥AP2結(jié)構(gòu)域?yàn)樘结標(biāo)阉鱊CBI的苜蓿屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)苜蓿屬ERF蛋白進(jìn)行鑒定和分析，并通過(guò)半定量RT－PCR技術(shù)對(duì)紫花苜蓿5個(gè)ERF基因的組織表達(dá)差異性和多種條件下的表達(dá)特性進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步開(kāi)展苜蓿ERF蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

以擬南芥 AP2結(jié)構(gòu)域（Genbank登錄號(hào)：1GCC＿A）為探針，運(yùn)用BlastP工具（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／）在NCBI的苜蓿屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，獲得的氨基酸序列根據(jù)ERF蛋白的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為：只含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，且不包含B3結(jié)構(gòu)域。剩余的氨基酸序列運(yùn)用MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；運(yùn)用瑞士生物信息學(xué)研究所網(wǎng)站的Protscale軟件（http：／／expasy.org／tools／protscale.html）進(jìn)行疏水性輪廓預(yù)測(cè)；PBIL LYON－GERLAND數(shù)據(jù)庫(kù)在線預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)；SignalP 3.0軟件（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）預(yù)測(cè)信號(hào)肽；ProtComp Version 9.0（http：／／linux1.softberry.com／berry.phtml）軟件預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位情況。

1.2 植物材料和處理

紫花苜蓿“中苜1號(hào)”由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草研究室保存及提供。挑選飽滿的種子播種于MS固體培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。生長(zhǎng)2周的幼苗轉(zhuǎn)入分別含有200 mmol／L NaCl、15%PEG6000、60μmol／L Al2（SO4）3、50μmol／L 生長(zhǎng)素（IAA）、100μmol／L 脫落酸（ABA）、50μmol／L 赤霉素（GA）、100 μmol／L水楊酸（SA）、40μmol／L乙烯利（Eth）和100μmol／L茉莉酸甲酯（MeJA）的1／2MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行處理。NaCl、PEG6000和 Al2（SO4）3的處理時(shí)間分別為0，1，6，12和24 h，激素處理的時(shí)間分別為0，1和12 h，處理完成后分別提取各處理的總RNA保存?zhèn)溆茫?011年6月14日在畜牧所試驗(yàn)地中挑選1株生長(zhǎng)3年且長(zhǎng)勢(shì)良好的苜蓿植株，分別取根、莖、葉、花蕾和花于液氮中速凍后－80℃保存，用于組織表達(dá)特異性分析。實(shí)驗(yàn)于2011年6月－2011年8月進(jìn)行。

1.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法分別提取各處理的總RNA，取100 mg幼苗全株于研缽中加入液氮充分研磨，轉(zhuǎn)入1.5 m L離心管中，加入1 m L Trizol試劑（博邁德，北京），漩渦振蕩器上劇烈震蕩1 min；加入0.2 m L氯仿，劇烈震蕩30 s后置于室溫3 min，4℃，12 000 r／min離心10 min后將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，冰上放置5 min，4℃，12 000 r／min離心10 min后棄上清，用75%的酒精懸浮沉淀2次；室溫晾干沉淀，加入30 μL焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水溶解沉淀，保存于－80℃?zhèn)溆谩Ｌ崛〉目俁NA參照M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Takara，大連）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。

1.4 半定量RT－PCR分析

根據(jù)核苷酸序列設(shè)計(jì)半定量引物，以紫花苜蓿肌動(dòng)蛋白基因（Actin）作為內(nèi)參，c DNA第一鏈為模板，對(duì)紫花苜蓿乙烯應(yīng)答因子基因表達(dá)的組織特異性以及不同處理下的表達(dá)特性進(jìn)行研究，所有引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為：H2O 17.25μL、10×buffer 2.5μL、d NTP 2μL、上下游引物各1μL、Taq DNA 聚合酶0.25μL、模板1 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，29個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后拍照并進(jìn)行分析。

表1 用于乙烯應(yīng)答因子半定量RT－PCR的引物Table 1 Primers for semi－quantitative RT－PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

以擬南芥AP2結(jié)構(gòu)域?yàn)樘结標(biāo)阉鬈俎俚鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得的氨基酸序列根據(jù)ERF家族的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行篩選，獲得41個(gè)與探針高度匹配且符合ERF家族結(jié)構(gòu)特征的氨基酸序列，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明這41個(gè)氨基酸序列又可分為5組（圖1）。從每組各選取1個(gè)成員（A1：ACJ84901.1；A2：ABO93372.1；A3：ACJ85181.1；A4：ABW06102.2；A5：ACJ84446.1），對(duì)它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性輪廓、信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明這5個(gè)蛋白都包含大量α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)（圖2），大部分區(qū)域表現(xiàn)為親水性（圖3），都沒(méi)有信號(hào)肽，定位于細(xì)胞核中。將這5個(gè)蛋白編碼基因的紫花苜蓿同源序列命名為MsERF1、MsERF2、MsERF6、MsERF7和MsERF9。

圖1 苜蓿乙烯應(yīng)答因子的進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of Medicago ethylene response factors

2.2 紫花苜蓿乙烯應(yīng)答因子基因表達(dá)的組織差異性

MsERF1基因在根和葉中的表達(dá)量高于莖、花和花蕾（圖4）；MsERF2在根、葉和花中的表達(dá)量最高，莖中的表達(dá)量次之，在花蕾中的表達(dá)量最低；MsERF6在葉和花蕾中的表達(dá)高于其他組織；MsERF7在根、莖、葉和花中高表達(dá)，在花蕾中的表達(dá)量較低；MsERF9在根、莖和葉中的表達(dá)量高于花蕾，在花中沒(méi)有表達(dá)。

2.3 NaCl處理對(duì)MsERF基因表達(dá)的影響

NaCl處理1 h后，MsERF1、MsERF7和MsERF9的表達(dá)量提高（圖5），且一直保持高表達(dá)水平；MsERF6的表達(dá)量在處理1 h后明顯升高，隨著處理時(shí)間的增加，表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，處理12 h后表達(dá)量恢復(fù)到?jīng)]有處理時(shí)的水平，處理24 h后表達(dá)量又有輕微上調(diào)；NaCl處理對(duì)MsERF2的表達(dá)沒(méi)有影響。

2.4 PEG6000對(duì)MsERF基因表達(dá)的影響

PEG6000處理?xiàng)l件下，隨著處理時(shí)間的增加，MsERF1的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)（圖6），在6 h達(dá)到最高值并保持高表達(dá)；MsERF7和MsERF9的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，在6 h表達(dá)量最高并保持一段時(shí)間（6～12 h），隨后表達(dá)量有輕微下降；MsERF6基因的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，在6 h達(dá)到最高值后呈下降趨勢(shì)，并最終下降到?jīng)]有處理時(shí)的表達(dá)水平；MsERF2的表達(dá)不受PEG6000誘導(dǎo)。

2.5 Al2（SO4）3 處理對(duì) MsERF 基因表達(dá)的影響

Al2（SO4）3能誘導(dǎo)這5個(gè)基因的表達(dá)，MsERF1的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的增加而上升（圖7），在24 h達(dá)到最大值；MsERF2基因的表達(dá)呈先上升后降低的趨勢(shì)，6 h的表達(dá)量最高；MsERF6基因的表達(dá)隨著處理時(shí)間的增加而上升，在6 h達(dá)到較高水平后呈下降趨勢(shì)，而后又呈上升趨勢(shì)；MsERF7和MsERF9的表達(dá)量在12 h達(dá)到最高，然后呈下降趨勢(shì)。

2.6 激素處理對(duì)MsERF基因表達(dá)的影響

脫落酸能誘導(dǎo)MsERF1、MsERF6、MsERF7和MsERF9的表達(dá)，其中MsERF1和MsERF6呈先上升后降低的趨勢(shì)，MsERF7和MsERF9的表達(dá)在短時(shí)間處理時(shí)沒(méi)有明顯變化，在長(zhǎng)時(shí)間處理?xiàng)l件下才表現(xiàn)上升趨勢(shì)，MsERF2的表達(dá)不受脫落酸誘導(dǎo)（圖8）；生長(zhǎng)素處理?xiàng)l件下，MsERF6的表達(dá)量先上升后降低，其他基因的表達(dá)量都沒(méi)有發(fā)生變化；茉莉酸甲酯處理?xiàng)l件下，MsERF1、MsERF6、MsERF7和MsERF9的表達(dá)量先上升后降低，而MsERF2的表達(dá)量呈一直上升的趨勢(shì)；水楊酸處理?xiàng)l件下，MsERF1的表達(dá)量在短時(shí)間沒(méi)有變化，在12 h表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，MsERF2和MsERF7的表達(dá)呈先上升后下降的趨勢(shì)，MsERF6和MsERF9的表達(dá)量在短時(shí)間就表現(xiàn)上升趨勢(shì)，且一直維持在高表達(dá)水平；赤霉素處理?xiàng)l件下，MsERF1的表達(dá)量一直上升，MsERF2和MsERF6的表達(dá)量先上升后下降；MsERF7和MsERF9的表達(dá)量在處理1h后有明顯上升，且隨著處理時(shí)間的增加，其表達(dá)一直維持在高水平；乙烯利處理?xiàng)l件下，MsERF1的表達(dá)隨著處理時(shí)間的增加呈一直上升的趨勢(shì)，MsERF2和MsERF9在短時(shí)間處理時(shí)表達(dá)量有顯著上升，然后維持在高水平；MsERF6和MsERF7的表達(dá)在短時(shí)間沒(méi)有明顯變化，處理12 h后，表達(dá)量上升。

3 討論

在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物逐漸形成由功能蛋白和轉(zhuǎn)錄因子組成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以適應(yīng)環(huán)境的變化。內(nèi)外環(huán)境被植物感知后轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N信號(hào)，通過(guò)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)，引起相關(guān)基因表達(dá)的改變，最終作出適應(yīng)性反應(yīng)。通常情況下，基因表達(dá)的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與順勢(shì)作用元件結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達(dá)。乙烯是五大類(lèi)植物激素之一，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答有密切關(guān)系，參與植物種子萌發(fā)、果實(shí)成熟、根生長(zhǎng)、花器官形成、葉和花的衰老等植物發(fā)育過(guò)程的調(diào)控，并調(diào)控植物應(yīng)答病害侵染和非生物脅迫等過(guò)程。通過(guò)對(duì)模式植物擬南芥的研究表明，植物體內(nèi)乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑為：外界信號(hào)→ETR→CTR→EIN2→EIN3→ERF→生理生化反應(yīng)［10－12］，乙烯應(yīng)答因子在整個(gè)乙烯信號(hào)通路中占據(jù)關(guān)鍵位置。

圖4 MsERF基因表達(dá)的組織差異性Fig.4 Expression analysis of MsERF genes in different tissues

圖5 NaCl處理下MsERF基因的表達(dá)量變化Fig.5 Expression of MsERF genes under NaCl treatment

轉(zhuǎn)錄因子在高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育及其對(duì)外界環(huán)境的反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用［13］。乙烯應(yīng)答因子是AP2／ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，只包含1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域且不包含B3結(jié)構(gòu)域。本研究以擬南芥AP2結(jié)構(gòu)域?yàn)樘结槪\(yùn)用BlastP工具在NCBI的苜蓿屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，獲得的氨基酸序列剔除AP2家族和RAV家族成員，剩余的序列符合ERF家族的結(jié)構(gòu)特征，即為苜蓿ERF家族成員。同大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子基因一樣，ERF基因的表達(dá)受到復(fù)雜的調(diào)控。大多數(shù)ERF基因都是誘導(dǎo)表達(dá)的，干旱、低溫、鹽堿、乙烯、脫落酸、病害、赤霉素、水楊酸等能誘導(dǎo)其表達(dá)，但是不同的ERF基因有不同的誘導(dǎo)表達(dá)模式，即使是同源性很高，同一條件下它們的表達(dá)模式也會(huì)有很大的不同。在已發(fā)現(xiàn)的同源性較高的ERF轉(zhuǎn)錄因子ORCAs中，ORCA2［14］和ORCA3［15］的表達(dá)受茉莉素誘導(dǎo)，調(diào)控啟動(dòng)子含有茉莉素應(yīng)答元件基因的表達(dá)，而ORCA1則不受茉莉素的誘導(dǎo)，本研究中的5個(gè)ERF基因在同一條件下的表達(dá)模式有差異，這與以前的研究結(jié)果吻合。

圖7 Al2（SO4）3處理下MsERF基因的表達(dá)量變化Fig.7 Expression of MsERF genes under Al2（SO4）3 treatment

圖8 激素處理下MsERF基因的表達(dá)量變化Fig.8 Expression of MsERF genes under hormone treatments

植物感知各種外界信號(hào)，形成不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，各種不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑可以形成交互作用［16，17］。由于交互作用的存在，植物在受到不同傷害時(shí)，往往會(huì)表現(xiàn)出同樣的適應(yīng)性反應(yīng)，交互作用是通過(guò)多個(gè)基因之間形成的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。作為植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，乙烯應(yīng)答因子在植物體內(nèi)多種信號(hào)通路中起著調(diào)控下游基因表達(dá)的功能，與植物的多種生理生化反應(yīng)都有密切關(guān)系。已有的研究表明，ERF基因參與植物的抗病反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育，以及對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答［18，19］。本研究結(jié)果表明同一個(gè)ERF基因同時(shí)受2種或多種條件的誘導(dǎo)，表明這些乙烯應(yīng)答因子可能在植物體內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的交互作用中發(fā)揮作用。

以前的研究表明ERF基因主要參與生物脅迫的應(yīng)答，也有研究表明它們參與非生物脅迫應(yīng)答。在擬南芥中超表達(dá)Br ERF4基因可以提高轉(zhuǎn)基因植物的抗鹽性和抗旱性［20］；在水稻（Oryzasativa）中超表達(dá)JERF3基因可以提高WCOR413－like，OsEnol和OsSPDS2基因的表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性和抗?jié)B透脅迫能力提高［21］；在水稻中超表達(dá)JERF1可以提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性［22］。本研究結(jié)果表明MsERF2基因的表達(dá)不受NaCl和PEG6000處理的影響，表明它可能不參與植物對(duì)滲透脅迫和Na／Cl離子毒害的應(yīng)答，而其表達(dá)受Al2（SO4）3的誘導(dǎo)，表明它參與鋁鹽毒害的信號(hào)傳導(dǎo)途徑；脫落酸被稱(chēng)為“脅迫酸”，植物存在依賴(lài)脫落酸和不依賴(lài)脫落酸的脅迫應(yīng)答機(jī)制，MsERF2的表達(dá)不受ABA的誘導(dǎo)，表明它屬于非ABA依賴(lài)型，其余4個(gè)基因都能被NaCl、PEG6000、Al2（SO4）3和ABA誘導(dǎo)，表明它們的脅迫應(yīng)答都屬于依賴(lài)ABA型；MeJA、SA、GA和Eth與植物的抗病蟲(chóng)性，5個(gè)基因的表達(dá)都能被這4種激素誘導(dǎo)，由此可以推測(cè)它們極有可能與苜蓿的抗病蟲(chóng)性相關(guān)；生長(zhǎng)素處理時(shí)只有MsERF6基因的表達(dá)受輕微影響，其余基因的表達(dá)量都沒(méi)有變化，據(jù)此推測(cè)它們都不參與到與IAA應(yīng)答的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。本研究通過(guò)半定量RT－PCR的方法對(duì)5個(gè)紫花苜蓿乙烯應(yīng)答因子基因的組織表達(dá)差異性及各種處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，對(duì)進(jìn)一步開(kāi)展這些基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究植物體內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)和不同信號(hào)傳導(dǎo)途徑的交互作用提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究以AP2結(jié)構(gòu)域?yàn)樘结標(biāo)阉鱊CBI的苜蓿蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)乙烯應(yīng)答因子的結(jié)構(gòu)特征對(duì)獲得的蛋白序列進(jìn)行鑒定。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明苜蓿乙烯應(yīng)答因子可以分為5組，從每組中選取1個(gè)成員進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性輪廓、信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位情況分析，結(jié)果表明這5個(gè)蛋白都包含大量α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，大部分區(qū)域表現(xiàn)為親水性，定位于細(xì)胞核中，都沒(méi)有信號(hào)肽；運(yùn)用半定量RT－PCR技術(shù)研究5個(gè)紫花苜蓿乙烯應(yīng)答因子基因（MsERF1，MsERF2，MsERF6，MsERF7，MsERF9）表達(dá)的組織差異性以及各種處理?xiàng)l件下的表達(dá)特性。結(jié)果表明，5個(gè)乙烯應(yīng)答因子基因在葉中的表達(dá)量都明顯高于其他組織，不同基因有不同的組織表達(dá)特性；NaCl和PEG6000對(duì)MsERF2的表達(dá)沒(méi)有影響，但Al2（SO4）3能誘導(dǎo)其表達(dá)，其余基因的表達(dá)都受這3種處理的誘導(dǎo)；脫落酸對(duì)MsERF2的表達(dá)沒(méi)有影響，能夠誘導(dǎo)其他基因的表達(dá)；生長(zhǎng)素只能影響MsERF6的表達(dá)，對(duì)其他基因的表達(dá)沒(méi)有影響；赤霉素、茉莉酸甲酯和乙烯利對(duì)5個(gè)基因的表達(dá)都起促進(jìn)作用。本研究為進(jìn)一步研究苜蓿蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為研究不同信號(hào)傳導(dǎo)途徑之間的交互作用提供了依據(jù)。

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