干旱脅迫對紫花苜蓿葉片和根系多胺代謝的影響

劉義，張春梅，謝曉蓉，閆芳，胡丹

（1.河西學院農業與生物技術學院，甘肅 張掖734000；2.張掖市甘州區兔兒壩天然植被管護站，甘肅 張掖734000）

＊紫花苜蓿（Medicagosativa）是世界上廣泛栽培的豆科牧草之一。目前，人們已充分認識到紫花苜蓿在發展畜牧業生產、建植人工草地、保護草地生態環境、綠化、美化生活環境等方面具有巨大的經濟效益和重要的社會效益。多胺（polyamines，PAs）是一類廣泛存在于原核生物及真核生物中具有強烈生物活性的低分子量脂肪族含氮堿。高等植物含有的多胺主要有腐胺（putrescine，Put）、亞精胺（spermidine，Spd）、精胺（spermine，Spm），以游離態、結合態和束縛態3種形態存在［1］。多胺含量的變化與植物的抗旱性關系密切［2－6］。

干旱是紫花苜蓿出苗及成苗的限制因子之一［7］。本試驗以隴東紫花苜蓿為材料，研究干旱脅迫下紫花苜蓿葉片、根系中多胺含量、精氨酸脫羧酶（arginine decarboxylase，ADC，EC 4.1.1.19）、鳥氨酸脫羧酶（ornithine deearboxylase，ODC，EC 4.1.1.17）和多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO，EC 1.5.3.3）活性的動態變化，探討紫花苜蓿體內多胺代謝與抗旱性的關系，以進一步探明內源多胺在紫花苜蓿抗旱性中的作用，為深入開展苜蓿抗旱機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

選用耐旱性較強的隴東苜蓿為試驗材料［8］。采用盆栽方式，盆口直徑為29 cm，深度40 cm。盆栽用土為河西內陸灌區灌漠土，土壤全氮、全磷和有機質含量分別為0.041%，0.009%和0.294%，田間飽和持水量19.72%，風干土土壤含水量為4.7%。每盆裝粉碎過篩的風干土10.4 kg，將尿素4.5 g、硫酸鉀4.5 g、過磷酸鈣15.0 g和腐熟有機肥200 g，作為底肥與過篩風干土混勻后裝盆。試驗在干旱棚內完成，設3個土壤水分處理：正常供水（對照，CK）、中度干旱脅迫（moderate stress，MS）和重度干旱脅迫處理（serious stress，SS），其土壤水分含量分別維持在土壤田間持水量的（75±5）%，（55±5）%和（35±5）%。每處理設置6個重復。稱重法控制土壤水分。于2010年11月18日播種，每盆12穴，每穴2粒，子葉展開后定苗，每盆5株，再設置空白對照10盆。在冬前正常供水，返青后（翌年3月25日起）開始控水，讓其自然干旱到田間持水量的（55±5）%和（35±5）%，此后一直維持該含水量。于脅迫處理后0，1，3，5，7 d取樣，選取真葉和根系測定相關指標，不同時間換株取樣。各處理取樣3次重復，指標測定時各樣品重復測定3次。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 PAs含量的測定 在劉懷攀等［9］方法的基礎上稍加變動。取冰凍樣品1.0 g，加入6 m L預冷的體積分數5%高氯酸冰浴研磨，冰浴浸提1 h后離心（12 000 r／min，30 min，4℃）。取1 m L上清液加入10 m L帶蓋塑料離心管中，加入20μL苯甲酰氯，再加入1 m L 2 mol／L NaOH，渦漩1 min后于37℃水浴反應30 min。加入2 m L飽和NaCl溶液，混勻后用2 m L乙醚萃取，5 000 r／min離心5 min后，取1 m L醚相真空干燥，用1 m L甲醇渦漩溶解后過0.45μm的濾膜。取10μL用Shimadzu（島津）LC－2010A型高效液相色譜儀檢測：紫外檢測器，層析柱為反向C18柱，流動相為V（甲醇）∶V（水）＝60∶40，流速0.7 m L／min，柱溫30℃，檢測波長230 nm。以腐胺、亞精胺、精胺（Sigma產品）制備標樣作標準曲線。多胺含量單位為nmol／g。

1.2.2 ADC、ODC活性的測定 參照趙福庚和劉友良［10］的方法并略加修改，取1.0 g冰凍材料，加入5 m L預冷的提取液（100 mmol／L磷酸緩沖液，p H 為8.0，內含5 mmol／L EDTA、0.1 mmol／L苯甲基磺酰氟、1 mmol／L磷酸吡哆醛、0.1%聚乙烯吡咯烷酮、5 mmol／L二硫蘇糖醇、20 mmol／L抗壞血酸、0.43 mmol／L硫代硫酸鈉），于冰浴中充分研磨，12 000 r／min冷凍離心15 min（4℃），取上清液鹽析、透析進行純化。取0.3 m L純化后的提取液加入0.2 m L 25 mmol／L底物（p H 7.5，ADC活性測定時加L－精氨酸，ODC活性測定時加L－鳥氨酸），反應之后進行苯甲酰化，用紫外分光光度計法測定波長254 nm處的OD值。以腐胺制備標樣作標準曲線。酶的活性以每g鮮質量樣品提取的酶液在單位時間內催化底物生成的產物Put的量來計算，酶活單位用nmol／（g·h）來表示。

1.2.3 PAO活性的測定 參照汪天等［11］的方法，用N，N－二甲基苯胺和4－氨基氨替吡啉作顯色劑，Spm啟動反應，記錄OD550處吸光值的變化，酶活性計算以反應液每min在550 nm處吸光值變化0.001為1個酶活單位（U），結果用“U／g”來表示（以鮮質量計算）。

1.3 統計分析

采用Excel和SAS軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下紫花苜蓿葉、根中游離態多胺含量的變化

干旱脅迫下，紫花苜蓿幼苗葉片中3種游離態多胺（Put、Spd、Spm）的含量均大幅度增加（表1），隨著脅迫時間的延長先上升后下降，且脅迫程度越大，多胺的增加幅度越大。中度脅迫處理下，Put、Spd、Spm的含量在脅迫后5 d出現峰值，分別比CK增加72.87%，68.91%和76.27%；重度脅迫處理下，3種多胺的含量在脅迫后3 d出現峰值，分別比CK提高1.57，1.46和1.19倍。各處理間3種多胺含量的差異均達極顯著水平（P＜0.01），整個脅迫期間各處理葉片多胺含量表現為重度脅迫＞中度脅迫＞CK。

表1 干旱脅迫下紫花苜蓿葉片中游離態多胺含量的變化（珔x±SD）Table 1 Changes of free－polyamines contents in leaves of alfalfa under drought stress nmol／g

隨著脅迫時間的延長，紫花苜蓿根中多胺含量先上升后下降（表2），變化趨勢與葉片中相似。中度脅迫處理下，根中Put、Spd含量峰值分別出現在脅迫后3 d，比CK增加73.38%和38.79%，Spm含量在脅迫5 d時最高，比CK增加90.62%；重度脅迫處理下，根中3種多胺含量均在脅迫1 d后出現峰值，較葉片中提早出現，之后迅速下降。各處理根中Put、Spd、Spm含量均低于葉片，整體表現為重度脅迫＞輕度脅迫＞CK。根和葉中Put、Spd、Spm含量之間的相關系數分別為0.946，0.808和0.817，表明根和葉中多胺含量呈極顯著相關（r0.01＝0.745）關系。

表2 干旱脅迫下紫花苜蓿根系中游離態多胺含量的變化（珔x±SD）Table 2 Changes of free－polyamines contents in roots of alfalfa under drought stress nmol／g

2.2 干旱脅迫下紫花苜蓿葉、根中多胺脫羧酶活性的變化

精氨酸脫羧酶（ADC）和鳥氨酸脫羧酶（ODC）為多胺生物合成的關鍵酶。干旱脅迫下紫花苜蓿葉片和根系中ADC、ODC活性變化趨勢相似（圖1，2）。隨脅迫程度增大，二者活性均增大，隨著脅迫時間的延長，二者活性先增大后減小。

圖1 干旱脅迫下紫花苜蓿ADC活性的變化Fig.1 Changes of ADC activities of alfalfa under drought stress

中度和重度脅迫處理下，紫花苜蓿葉片中ADC活性分別在脅迫后5和1 d開始下降，而根中ADC活性分別在脅迫后3和1 d開始下降，各處理間ADC活性均達極顯著差異（圖1）。

脅迫處理下，葉片和根系ODC活性在脅迫3 d后同時達到最高。對葉片和根中ADC、ODC活性與Put含量進行相關分析，呈極顯著正相關，相關系數分別為0.817，0.806和0.853，0.904（r0.01＝0.745）。

2.3 干旱脅迫下紫花苜蓿葉、根中多胺氧化酶活性的變化

植物體內多胺氧化酶（PAO）催化亞精胺和精胺分解產生的H2O2，會對植物細胞造成一定的傷害。干旱脅迫下，紫花苜蓿葉片和根系中PAO活性上升，處理期間PAO活性上升幅度隨脅迫程度加重而增大，隨脅迫時間的延長，各處理PAO活性呈先增大后減小的趨勢（圖3），這與Spd、Spm含量變化相似。干旱脅迫下，紫花苜蓿葉中PAO活性與Spd、Spm含量相關系數為0.925和0.917，根中相關系數為0.785和0.871，表明PAO活性與Spd、Spm含量極顯著相關（r0.01＝0.745）。

圖2 干旱脅迫下紫花苜蓿ODC活性的變化ig.2 Changes of ODC activities of alfalfa under drought stress

圖3 干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗PAO活性的變化Fig.3 Changes of PAO activities of alfalfa under drought stress

3 討論

植物感受干旱脅迫時，多胺水平升高，PAs含量的積累與植物抗旱性關系密切［2－6］。PA可通過穩定質膜和提高細胞內保護酶（超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶）活性［12］以及提高ABA含量或改變不同激素成分的含量［13］來增強對滲透脅迫的抵抗能力。逆境脅迫下，活性氧的產生與清除體系與多胺存在著重要的關聯［14，15］。苜蓿幼苗葉片多胺含量顯著升高［16］。本研究結果表明，干旱脅迫誘使紫花苜蓿游離態Put、Spd、Spm的含量增加及ADC、ODC、PAO代謝酶活性提高。由此可以推斷，干旱脅迫下，紫花苜蓿體內多胺代謝的變化是對干旱逆境的一種抵御和適應機制。這與關軍峰等［2］和牛明功等［3］在小麥（Triticumaestivum）的研究結果一致。Spd和Spm能夠顯著增強低溫脅迫下茄子（Solanummelongena）幼苗的耐冷性［17］。Sara等［18］研究認為，不同多胺在抗旱中的作用因不同植物而存在差異［3－6］。

PAO是催化生物體內PAs降解的關鍵酶之一，Put和Spd的過度積累將作為一種很好的底物激發PAO活性，PAO通過調節細胞內PAs的水平和生成物濃度參與植物體對逆境脅迫的反應和生長發育過程［19］。干旱脅迫下，紫花苜蓿中PAO活性與Spd、Spm含量變化趨勢相似且呈極顯著相關，可能是Spd、Spm二者含量的增加反饋致其氧化酶PAO活性增高，進而維持多胺代謝平衡［20］。本試驗中，中度脅迫處理下紫花苜蓿幼苗根中多胺含量峰值比葉片中出現較早，說明根中多胺反應較葉中更敏感。這可能由于干旱來臨時根系最先感知并迅速產生化學信號向地上部葉片傳遞［19］。

在植物體內，Put的生物合成途徑主要有2條：一條是以鳥氨酸為前體，在ODC的作用下形成Put；另一條以L－Arg為前體，在ADC的作用下間接形成Put。Spd和Spm分別由S－腺苷蛋氨酸脫羧酶（SAMDC）催化形成脫羧的dcSAM生成。在植物受到環境脅迫時，ADC、ODC和SAMDC活性往往升高，Put的合成酶ADC和ODC的活性增加，合成的Put增多，而Put可轉化為Spd，進一步轉化為Spm，致使總PAs含量顯著增加［20］。銅脅迫下，黃瓜（Cucumissativus）嫁接苗根系ADC、ODC和SAMDC活性升高，表明嫁接幼苗根系PAs含量維持在較高水平有利于提高黃瓜幼苗抗銅脅迫能力［21］。本研究結果顯示，干旱脅迫下紫花苜蓿葉片和根中ADC、ODC活性與Put含量變化趨勢一致，表明ADC、ODC共同調控脅迫條件下植物Put的合成代謝。這與汪耀富等［4］的研究結果一致。

4 結論

干旱脅迫誘使紫花苜蓿幼苗葉片、根系中Put、Spd、Spm含量增加。ADC、ODC、PAO活性均呈先上升后下降的趨勢。PAO活性與Spd、Spm含量變化趨勢相似且呈極顯著相關關系，ADC、ODC活性與Put含量呈極顯著正相關。葉和根中多胺代謝顯著相關。3種多胺處于動態平衡中，共同緩解紫花苜蓿受到的干旱脅迫，表明多胺代謝與紫花苜蓿抗旱性關系密切。

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