血小板微粒體與缺血性腦卒中的相關性研究進展

蕭 云綜述，陳煜森審校

（廣東醫學院附屬醫院神經內科，廣東 湛江 524000）

血小板微粒體(Platelet microparticles，PMP)主要為血小板在受到不同刺激作用下細胞膜向外伸展變形，細胞膜部分以出芽方式形成小囊泡或偽足脫落進入微循環而形成的細小微粒，是血小板粘附或活化的產物。PMP的體積小于正常的血小板，直徑0.1～1.0 μm，但具有完整的膜結構，其膜的成分與血小板相同，表達一些血小板的膜糖蛋白（GP）、血小板活化因子（PAF）、β-淀粉樣前體蛋白、Ca2＋依賴性蛋白酶（Calpain）和有促凝作用的磷脂等。PMP是血液循環中含量最多的微粒體，占所有微粒體的70%～90%，在多種生理和病理過程中起著重要作用。正常人血液中含有少量PMP。本文就血小板微粒體的生物特性、檢測及其在缺血性腦卒中的研究進展做一綜述。

1 血小板微粒體的生物學特點

1.1 血小板微粒體的來源及形成機制 體內PMP主要來源于活化的血小板；而體外研究PMP的產生，必須先通過各種途徑激活血小板。目前研究發現高切應力和多種激活劑，如凝血酶、膠原、腎上腺素、ADP、鈣離子載體A23187及終端補體復合物C5b-9、抗血小板抗體等有關，作用于血小板均可引起PMP的釋放，但不同的激活劑誘導所產生的PMP大小相差甚遠。PMP的形成和釋放機制目前尚不十分清楚，但普遍認為細胞膜極性丟失及細胞膜骨架重排起到重要的作用。

細胞膜脂質雙層中的脂質成分呈不對稱分布，帶負電荷的氨基磷脂（磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺）幾乎全部分布在膜靠近胞質的內層，而磷脂酰膽堿和鞘脂主要分布在膜的外層。細胞通過酶消耗能量來維持膜脂質不對稱性，在此過程中氨基磷脂轉移酶、翻轉酶（Flippase）和磷脂爬行酶（Scramblase）起到重要作用。當細胞受到促凝、促炎癥等刺激時通常引起胞外Ca2+內流或胞內Ca2+貯存庫的釋放，導致胞漿Ca2+濃度升高，進而氨基磷脂轉移酶和Scramblase激活，同時Flippase受到抑制，最終致使膜磷脂重新分布，磷脂酰絲氨酸（PS）由膜內層遷移至外層，引起PS暴露、出芽。鈣離子流增加還可以活化Calpain，從而引起細胞骨架蛋白分子的變化。Calpain活化使細絲蛋白與肌球蛋白裂解，打亂維持支撐細胞膜的正常細胞骨架結構，可引起細胞收縮和細胞骨架重建，細胞外形改變、出芽，這些隆起的泡狀物擠壓胞膜并脫落，因此脫落的細胞微粒整合了一部分的源細胞膜表面蛋白和其他成分。

研究發現早期凋亡的血小板通過細胞膜骨架的重塑和出芽方式也可以產生血小板微粒體。早期凋亡的細胞產生微粒體依賴于pho相關的激酶ROCK1，這個酶是通過CASPASE蛋白酶裂解介導激活的，通過裂解激活的ROCK1可以促進細胞膜中肌球蛋白輕鏈的磷酸化以及肌動蛋白肌絲耦合斷裂，進而引起細胞膜骨架的重排，最終導致微粒體的產生。

2009年，Flaumenhaft等[1]發現在培養中鼠和人的巨核細胞中可產生CD41及CD61陽性的微粒，但不同于血小板分泌的PMP，不表達CD62或LAMP-1，而且細胞骨架含量下降，為健康人群中PMP絕對組成部分。2010年，Rank等[2]發現骨髓經過放射后，循環血中CD61陽性微粒大部分消失，而CD62陽性微粒繼續存在，進一步支持了巨核細胞來源的PMP。

1.2 血小板微粒體的生物學功能。

1.2.1 促凝血功能[3]PMP具有促凝血活性，來自血小板激活過程中所釋放的其表面富含的PS、Ⅷ因子和Va因子。PS促進了細胞和細胞之間的相互作用及在Ca2+存在的條件下促凝血；Ⅷ因子為Tenase酶復合物形成的協同因子；Va因子結合Xa因子后可形成凝血酶原酶的復合物。雖然Ⅷ因子連接血小板是不穩定的，但Ⅷ因子和Va因子可穩定地結合于PMP的表面，因此PMP可以不依賴血小板的激活而促進凝血，且這種促凝血活性比血小板激活所致的凝血能夠持續更長的時間。PMP經血小板活化形成之后，又可通過其含有的PAF、Calpain、PS等直接活化血小板，并且通過GPⅠb與內皮下基質結合作為底物促進血小板進一步粘附于內皮細胞。此外，PMP還可通過與內皮細胞、單核細胞的作用而促進血小板的活化。

1.2.2 抗凝血功能 PMP可通過抑制蛋白C激活Va因子通路而抑制凝血功能，蛋白C的抑制劑可結合于血小板和PMP表面的磷脂酰乙醇胺，從而有效抑制磷脂所激活的蛋白C的通路。目前認為PMP具有的抗凝活性可能與磷脂在內外小葉之間的不完全翻轉有關，但以促凝血還是抗凝血為主的具體機制仍需要進一步研究探討[4-5]。

1.2.3 傳遞生物信息的作用 PMP通過與靶細胞發生粘附，將其胞膜上生物活性物質或胞漿成分傳遞給靶細胞，從而影響靶細胞的生物學功能。例如：PMP可激活平滑肌細胞MAPK p42/44的通路[6]；PMP通過轉移CD41抗原而增強骨髓來源的造血干細胞對膠原蛋白的粘附能力[6]；PMP表達CXCR4，可將其傳遞給CXCR4(-)細胞，結果導致這些細胞獲得對HIV的易感性[7]。

2 血小板微粒體的檢測方法

目前大約75%的實驗室在使用流式細胞儀（FCM）測定PMP，是最常用的檢測方法。但其他細胞如紅細胞、單核細胞、白細胞等也能產生直徑小于1.0 μm的微顆粒，細菌塵粒等污染都可能干擾PMP的定量測定。FCM測定法可利用PMP表面的抗原熒光抗體對其膜上的特異蛋白進行標記，進一步對其加以區別，然后根據其前向角散射光（FS）及熒光強度（FL）進行定量檢測。常用的方法有：全血法、富含血小板血漿（PRP）法、乏血小板血漿（PPP）法、內參定位法及改良流式細胞術等。PRP法樣品處理過程簡單，只需制備PRP，避免了PPP法中多次離心所造成的PMP丟失，成為大多數實驗室的首選方法。

流式細胞儀檢測微粒的大小受到波長的限制，小于0.5 μm的微粒很難檢測到，盡管新型的流式細胞儀和使用微球定位能檢測到0.3 μm的微粒，甚至更小的微粒，但是通過對比其他檢測技術（如原子力量顯微鏡），發現流式細胞儀低估了PMP的數量[8]。此外，由于PMP亞型的性質不同，單用某種抗體標記物也可以低估PMP的數量。

在檢測過程中由于使用流式細胞儀機器型號、樣本處理、參數設置及分析方法不同，導致FCM測定的血小板微粒體數量范圍在100～40 000/μl之間廣泛波動，因此國際血栓與止血協會的科學標準委員會發布了FCM標準化PMP檢測指南[9]，而且被證實能在不同實驗室可靠檢測PMP[10]。在檢測之前，樣本的處理也同樣要標準化，包括樣本的離心步驟，冰凍、抗凝、延遲時間、運輸、保存、融解等環節亦需進一步探討[11-12]，但這方面的報道比較少，此外，分析方法亦需要一個統一的標準。

一些新的技術如以阻抗為基礎的流式細胞術、電化學阻抗分析、原子力量顯微鏡、動態光散射檢測在PMP的檢測取得很大的進展，特別是可以不管微粒的大小檢測所有的微粒，但上述儀器昂貴稀少以致難以有效廣發應用，并且缺乏有效的抗體分子標記物。總而言之，盡管FCM存在缺陷，但因其操作簡便，速度快和結果準確，目前仍是最好檢測PMP的方法，特別是臨床應用。

3 血小板微粒體在缺血性腦卒中的臨床意義

3.1 血小板微粒體與不同亞型缺血性腦卒中的相關性 1996年，Bulboac?[13]用電子顯微鏡觀察到缺血性腦卒中患者血小板活化釋放微囊泡（Microvesicles），而健康個體中觀察不到這種現象。研究發現一名特發性血少板減少性紫癜（ITP）伴有進展性認知功能障礙的患者，血樣中PMP數量明顯增高。回顧分析這些患者發現，沒有出血癥狀的患者比有出血癥狀的患者PMP增高，伴有認知功能障礙的患者PMP增高更明顯，這些患有認知功能障礙的患者經MRI證實有腦缺血疾病，因此推測PMP在ITP患者中替代了血小板功能而限制出血，在高水平時誘發腦微血管的血栓形成[14]。隨后Ahn等[15]通過增加觀察樣本及采用更先進的影像學檢測進一步證實了上述觀點。于是在非ITP的缺血性腦血管疾病患者中是否能觀察到PMP增高這個問題引起了廣泛興趣。Lee等[16]及其研究團隊觀察了短暫性腦缺血（TIA）、小血管腦卒中、大血管腦卒中、多發性硬化及阿爾茨海默病患者，發現除了阿爾茨海默病外，都能夠觀察到PMP數量增高，而且小血管腦卒中比大血管腦卒中增多得更明顯，因此，推測長期及高水平的PMP或者某些亞型PMP可能會誘導腦缺血。1998年，在人工心臟瓣膜患者的研究中，Geiser等[17]首次報告了腦血管疾病與外周血PMP之間的病理生理聯系。

3.2 在缺血性腦卒中急性期的血小板微粒體變化 在腦梗死的急性期可以發現外周血PMP水平升高。2003年，Cherian等發現[18]，在腦梗塞急性期，外周血PMP升高與內皮功能異常的標記物P-選擇素和E-選擇素等相關，而且E-選擇素血液濃度的升高與全部類型腦梗死強相關，特別是由大動脈的動脈粥樣硬化所致的腦梗死。2009年，Kuriyama等[19]拿發現在腦梗塞急性期血液中的PMP（ELISA法評估）水平升高，而其升高與頸動脈內膜中層厚度（IMT）和頸動脈顱內段狹窄相關。與心源性中風的患者相比，大腦前、后、中動脈腦梗死及腔隙性腦梗死患者的PMP水平顯著性升高，這可能有助于心源性和血栓性中風之間的鑒別診斷。小血管閉塞或大血管閉塞所致急性期腦梗塞的PMP水平均比對照組高，其升高與伴隨的IMT、顱內動脈狹窄顯著性相關，這些證據是非常支持血液PMP水平可作為動脈粥樣硬化斑塊的生物評價的重要指標[20]。Csongrádi等[21]在肥胖患者中發現PMP水平與IMT以及動脈粥樣硬化其他危險因素存在正相關，進一步支持上述觀點。

3.3 在缺血性腦卒慢性期中的血小板微粒體變化 在腦梗死慢性期，外周血PMP水平仍然升高，并且未受一些特殊的抗血小板治療所影響（阿司匹林聯合西洛他唑）[22]。而相反，TIA患者經抗血小板治療（阿司匹林和氯吡格雷的組合）可使外周血PMP下降[23]。由于PMP的水平在腦梗死慢性期與腦梗死急性期比較仍然是不變的，因此，腦梗死患者PMP可能是腦動脈粥樣硬化斑塊的剪應力增加評估的特異生物指標。Maria等[24]在評估腦梗死慢性期血小板活性及反應性時發現，PMP水平增高與P-選擇素呈負相關，血小板活性逐漸增高，PMP分離現象占主導優勢，容易受到抗血小板藥物的影響。由于PMP促凝作用及血栓形成的特性，不利于腦梗死預后。因此，腦梗死患者PMP的評估不僅顯示血小板活化，而且可顯示內皮功能障礙，可能是一個重要的預后參數。

3.4 治療缺血性腦卒的潛在策略 盡管目前對PMP水平增高誘發了腦梗死還是腦梗死導致PMP水平增高仍存在爭議，但2008年Ahn就提出了將降低PMP作為治療腦梗死的手段。抑制PMP的形成或者阻斷各細胞來源微粒體的相互作用是兩種基礎的方法。目前已經清楚有幾種微粒體抑制劑，例如Calpain抑制劑，然而這些藥物是否適合人體內使用仍在探索階段。PMP抑制劑還可以明顯抑制來源于內皮細胞的微顆粒形成，獲得收益遠遠超過其已知的藥理學作用。

綜上所述，PMP主要來源于活化的血小板，參與正常生理及病理情況下的止血過程，可反映血栓或血栓前狀態。FCM檢測PMP的方法具有操作簡單及客觀精密等優點，為其在臨床的廣泛應用提供了有效的檢測手段。PMP的定量檢測對腦梗死的診斷、治療和預后評估有重要意義。PMP在腦缺血性疾病發病機制中起重要作用，但其具體作用機制仍不清楚；抑制PMP形成成為治療腦梗死的新策略，但缺乏循證醫學證據支持；已知幾種抑制PMP生成的藥物，但在人體實驗中尚缺乏穩定性。深入研究PMP的生理病理效應將為進一步揭示腦梗死的發病機制、特異性治療方法及預防提供重要的理論依據。

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