噬菌體生物擴增法在關節結核診治中的臨床應用研究

李 卓，劉曉艷，申 勇，呂翠環，劉豐勝，賈晨光

（1.河北省胸科醫院骨科，河北石家莊050041；2.冀中能源峰峰集團邯鄲醫院外科，河北邯鄲056200；3.河北醫科大學第三醫院脊柱外科，河北石家莊050051）

噬菌體生物擴增法在關節結核診治中的臨床應用研究

李 卓1，劉曉艷2，申 勇3，呂翠環1，劉豐勝1，賈晨光1

（1.河北省胸科醫院骨科，河北石家莊050041；2.冀中能源峰峰集團邯鄲醫院外科，河北邯鄲056200；3.河北醫科大學第三醫院脊柱外科，河北石家莊050051）

目的探討噬菌體生物擴增法（Phage amPlified biologically assay，PhaB）快速檢測關節結核膿液中結核分枝桿菌的臨床應用價值。方法采用PhaB技術對關節結核患者36例，非結核性關節炎患者20例關節液中的結核分枝桿菌進行檢測，同份標本同時進行涂片抗酸染色、羅氏培養。結果36例關節結核積液，PhaB陽性率為47.2%（17/36）、涂片抗酸染色陽性率為2.7%（1/36）、羅氏培養陽性率為5.5%（2/36）。20例非結核性關節炎患者PhaB、涂片抗酸染色、羅氏培養特異性均為100.0%。結論PhaB法檢測關節積液中結核分枝桿菌只需2d，操作簡便、靈敏度高、特異性強，不需要特殊儀器設備，可作為診斷關節結核的一種好方法。

結核，骨關節；分枝桿菌屬；噬菌體擴增實驗

細菌學方法檢測關節液中結核分枝桿菌時間長，涂片陽性率低。近年來非結核分枝桿菌所致關節感染增加［1］，同時結核耐藥菌增多，特別是耐多藥結核菌的出現使得常規抗結核療效不佳，因而，關節結核的病原學檢測早期診斷及治療顯得尤為重要。對疑似耐藥的病例，通常術前或術中獲取標本，行結核分枝桿菌快速培養+藥敏，或基因芯片快速診斷耐藥，制定個體化化療方案［2-3］。傳統的分離培養結核分枝桿菌方法檢出率雖然較高，但實驗過程耗時較長。涂片法雖然時間短、價格低廉，但分辨不出活菌和死菌，而且檢出率偏低，在臨床工作中應用有一定困難。分子生物學新興技術，包括基因芯片技術、聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction，PCR）技術，費用較高，操作技術難度大，在基層醫療機構難于推廣。噬菌體生物擴增法（PhageamPlified biologically assay，PhaB）以簡便、快速、特異性高等特性，能快速準確地檢出結核分枝桿菌，使關節結核病的快速早期診斷成為可能［4］。本研究將PhaB法技術應用于關節結核的臨床診治，早期檢測其關節液中結核分枝桿菌，探討研究該方法在關節結核早期診斷、藥敏、治療中的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象：2009年5月—2011年2月在本院就診的關節結核患者36例，男性24例，女性12例，年齡16～81歲，平均45.3歲。膝關節18例，肩關節3例，腕關節6例，踝關節3例，髖關節6例。所有患者均有長期（3個月～3年，平均1.3年）不同程度的膝關節腫脹、疼痛及活動受限。膿腫形成者，局部穿刺抽取膿液，常規留取關節液標本。另選取同期非結核性關節炎患者20例，男性12例，女性8例，年齡12～64歲，平均42.5歲。膝關節8例，髖關節6例，肩關節2例，腕關節2例，踝關節2例。患者均有長期（3個月～2年，平均1.2年）不同程度的膝關節腫脹、疼痛及活動受限，常規留取關節液標本。納入標準如下。①根據病史、臨床表現、影像學檢查初步診斷。②根據彩色超聲及影像學檢查顯示有關節積液形成。在無菌操作下關節穿刺抽取術前及術中積液，迅速送檢，冷藏保存，及早檢驗，防雜菌污染、標本失效等。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要儀器及試劑：結核分枝桿菌噬菌體試劑盒（FastPlaque TB TM）由英國BiotecLaboratories Ltd公司生產，上海金浩科技發展有限公司提供。BACTEC MGIT-960全自動結核分枝桿菌培養系統，美國Becton Dickinson公司生產。改良羅氏培養基按《結核病診斷細菌學檢驗規程》［5］自配。

1.2.2 PhaB法：①試劑準備，按照試劑盒說明在無菌條件下配制所需試劑，包括培養基生長補充劑、敏感細胞溶液、瓊脂和噬菌體等。②積液標本處理，將2mL積液標本與同體積4%NaOH加入50mL無菌有蓋離心管中，漩渦振蕩20～30s，充分消化混勻、室溫孵育15min，再加培養基生長補充劑20mL，4 000r/min離心15min，棄去上清液后再加1mL培養基生長補充劑，重懸沉淀物（確保打散），用無菌吸管吸取0.1mL混懸液，轉移至反應管中為備用待檢菌液。③含菌培養基的制備，分別取0.1mL噬菌體溶液加入各反應管中充分混勻，37℃孵育1h后分別加入0.1mL殺病毒劑，充分混勻，置室溫5min后各加1mL敏感細胞溶液和5mL培養基液，混勻后立即將冷卻至（55±2）℃的5mL瓊脂倒于各反應管顛倒混勻，內容物倒入無菌培養皿，室溫定型后將培養皿放于37℃培養箱中培養18～24h。每次檢測均同時設置陰性對照和陽性對照，陰性對照為無菌培養基生長補充劑，用于檢測殺病毒劑的有效性。陽性對照為稀釋16倍的敏感細菌溶液，用于檢測噬菌體和敏感細胞的有效性。

1.2.3 抗酸染色和羅氏培養：同份關節液標本同時進行離心涂片抗酸染色鏡檢，改良羅氏培養，操作方法按《結核病診斷細菌學檢驗規程》［5］執行。

1.3 結果判讀：按試劑盒說明。實驗組，陰性結果≤19個噬菌斑，陽性結果≥20個噬菌斑。對照組，陰性對照≤10個噬菌斑，陽性對照≥20個噬菌斑。

1.4 統計學方法：應用PEMS3.1軟件進行統計學處理，計數資料以百分率表示，不同檢測方法比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

3種方法對36例關節結核患者陽性率分別為PhaB法52.7%（19/36）、抗酸染色8.3%（3/36）、羅氏培養30.5%（11/36），PhaB法陽性檢測率明顯高于涂片和羅氏培養，差異有統計學意義（χ2= 38.725、35.821，均P＜0.01）。檢測20例非結核性關節炎患者的PhaB法、抗酸染色、羅氏培養特異性均為100.0%。

3 討 論

關節結核是臨床上較常見的疾患，常發生于少年和兒童，以髖關節和膝關節多見，肘關節、腕關節、踝關節次之。分原發性和繼發性，原發性病灶首先累及滑膜稱為滑膜型結核，后者由骨關節端結核病灶蔓延擴散所致，稱為骨型。關節結核是結核分枝桿菌對關節的滑膜、骨及軟骨感染、破壞為主的一系列病理過程。本病以繼發感染為主，多繼發于肺結核［6］，由肺部病變后血運轉移至骨關節發病。患者肺部病變多已吸收、纖維化或鈣化。原發病灶形成多在幼年時期，結核分枝桿菌生長緩慢，通過原發病灶進入血運，隨血行到達骨與關節組織中，機體免疫系統可殺滅絕大部分，少數未被消滅的結核分枝桿菌如沒有適宜的生長環境，則長期潛伏，處于靜止或休眠狀態，在機體的免疫力及抵抗力降低或其他不利因素的影響下，結核分枝桿菌迅速大量繁殖，突破包圍的纖維組織結構，其數量和毒性較前增加，產生液化、增殖及干酪壞死病變，炎癥擴大，產生局部癥狀和全身結核中毒反應導致發病，關節結核由此產生。關節結核缺少特異性的臨床表現，臨床對初診患者確定診斷的難度較大，誤診率高，延誤治療導致關節功能喪失。長期應用的細菌學方法檢測關節液中結核分枝桿菌涂片耗時較長，且陽性率低。結核分枝桿菌分離培養方法是一種傳統的檢測方法，臨床應用中陽性率較高，但過程費時較長。涂片法速度快、價格低廉，但在活菌和死菌上不能分辨，而且細菌檢出率較差，無法在臨床中應用。PhaB技術是Wilson等［7］于1997年建立的一種快速檢測結核分枝桿菌技術，基本原理是結核分枝桿菌與噬菌體混合孵育時，噬菌體感染結核分枝桿菌，隨后加入殺病毒劑殺死未感染的噬菌體，而菌體內的噬菌體不受影響。感染的噬菌體在靶菌體內繁殖并裂解釋放子代噬菌體，這些噬菌體又感染和裂解隨后加入的敏感細胞（恥垢分枝桿菌，快速生長型分枝桿菌），在瓊脂培養基上形成噬菌斑。因此，可根據噬菌斑的有無判斷標本中是否存在活的分枝桿菌［8］。噬菌體和敏感細胞快速的生長繁殖，結果在18～24h內就可觀測出來，結核分枝桿菌可以被可靠、迅速地檢驗，并且可以鑒別其是否為活體細菌，這對關節結核的早期臨床診斷和指導抗結核藥物治療具有重要價值及意義。

本實驗顯示，PhaB法檢測結核性關節積液中結核分枝桿菌的陽性率為52.7%，明顯優于傳統的涂片找抗酸菌8.3%和羅氏培養30.5%；特異性為100.0%。表明PhaB檢測的優越性［9-10］。目前，臨床診斷結核病的檢驗法有很多種，結核分枝桿菌抗酸染色是當前最廣泛的應用檢測之一，該檢測方法價格低廉，速度快，簡單易行，便于推廣，對于含菌量較高的樣本檢出率高，但對含菌量較低的腹腔積液、胸腔積液及關節液等樣本檢出率明顯減低，不能達到早期診斷結核病的目的。羅氏培養法的陽性率雖然較涂片法高，但不能快速診斷及明確藥物敏感性，對臨床上需要早期診斷并應用敏感抗結核藥物的要求不能滿足。實驗過程中注意事項：①嚴格在無菌原則下抽取關節積液，裝入無菌的容器內，冷藏保存，防止其他雜菌污染等；②消化液選擇4%NaOH，根據積液的稀稠度及是否含有干酪樣壞死物，應當增加消化的時間以確保效果；③為避免殺死噬菌體，澆注時瓊脂的溫度不應過高，控制在（55±2）℃；④實驗過程嚴格遵守無菌原則，以免出現假陽性結果；⑤與少數幾種非結核分枝桿菌有交叉反應，有文獻［11］報道與恥垢分枝桿菌、金色分枝桿菌、偶然分枝桿菌、草分枝桿菌會出現陽性或弱陽性反應，從而造成假陽性；⑥影響實驗準確因素復雜，藥物的濃度和作用溫度、作用時間、澆注平板時的瓊脂溫度以及殺毒劑濃度和混勻情況等都可以對檢測結果的準確性造成影響。

在臨床中關節結核早期與滑膜炎及關節炎不易鑒別，常延誤治療，對關節功能造成嚴重后果。PhaB作為檢測結核分枝桿菌的一項新方法，在結核病的臨床研究及診治中具有重要的作用。PhaB已經成熟應用在結核病的早期快速診斷、治療等各方面，目前常用于肺部結核診斷治療。本研究表明PhaB在關節結核中的應用是可靠并切實可行的，其簡便、經濟、快速，并具有較高敏感性和特異性的優點，對關節結核的早期診斷、治療、保護關節功能具有重要意義。

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（本文編輯：趙麗潔）

EXPERIMENTAL STUDY OF RAPID DETECTION OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS IN JOINT FLUID BY PHAGE AMPLIFIED BIOLOGICALLY ASSAY

LI Zhuo1，LIU Xiaoyan2，SHEN Yong3，LV Cuihuan1，LIU Fengsheng1，JIA Chenguang1
（1.Department of Orthopedics，the Chest Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050041，China；2.Department of Surgery，the Jizhongnengyuan Handan Hospital，Handan 056200，China；3.Department of Spinal Surgery，the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050019，China）

ObjectiveTo evaluate the clinical value of Phage amPlified biologically（PhaB）assay to detect mycobacterium tuberclosis in joint fluid.MethodsThe joint fluid samPles，from 36 Patients with joint tuberculosis and 20 Patients without joint tuberculosis，were detected by PhaB assay. ReSultS The Positive rate of PhaB assay in 36 Patients with joint tuberculosis was 47.2%（17/36），those of smear and culture were 2.7%（1/36）and 5.5%（2/36）resPectively.Twenty samPles without joint tuberculosis were all negative by above three methods.ConclusionThe exPerimental Procedure of PhaB assay costs only 2 days，and it is a simPle，highly sensitive and sPecific method for the diagnosis of joint tuberculosis.

tuberculosis，osteoarticular；mycobacterium；Phage amPlified biologically assay

R529.2

A

1007-3205（2012）05-0525-03

2012-02-28；

2012-05-09

河北省醫學科學研究重點課題計劃（20090262）

李卓（1975-），男，河北隆堯人，河北省胸科醫院主治醫師，醫學碩士，從事骨科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.05.012