不同條件下鄰苯二酚及其衍生物捕獲自由基性能研究

渠 暢，潘 晶，莊長福，張加研，田 珩，秦永劍

（1.西南林業大學材料工程學院，云南 昆明 650224；2.廣西民族大學，廣西林產化學與工程重點實驗室，廣西 南寧 530006）

抗氧化劑和氧自由基方面的研究是近年來生物化學和醫學界非常引人關注的領域。自由基與人的病理、生理有密切關系，防止自由基的氧化作用，對防治疾病保障健康具有積極意義[1]。自由基可通過體內抗氧化劑來清除，但機體內抗氧化劑往往不足，所以尋找外源性抗氧化劑對于預防疾病發生和保持機體健康是十分有益的[2]。

研究發現多酚類化合物可以延緩腫瘤的發作，減慢腫瘤的形成，提高認知功能，抑制低密度蛋白氧化及抑制血小板凝集等功能[3]，這些功能都與酚羥基的抗氧化性能有關。具有鄰二酚羥基的酚類化合物是高效抗氧化劑。鄰二酚羥基的鄰位酚羥基形成分子內氫鍵，有利于酚氧自由基的穩定；鄰二酚羥基的酚羥基與氧自由基反應形成共振穩定的半醌式自由基而中斷鏈式反應[4]。抗氧化劑形成半醌式自由基越穩定，其清除自由基的能力就越強。

在不同環境下，抗氧化劑的活性也有很大變化。Ingold 等人研究發現，同一抗氧化劑在不同的溶劑中與相同自由基反應的速率常數差別很大[5~8]。Nau等人報道在模擬生物膜體系中，隨著pH值的降低，維生素C 的抗氧化活性增強[9]。

本文首先研究鄰苯二酚及其衍生物（4- 甲基兒茶酚、對叔丁基鄰苯二酚和咖啡酸）捕獲ABTS+·自由基的性能，然后通過改變溶解鄰苯二酚及其衍生物的溶劑的酸堿性，在不同條件下研究這些化合物的抗氧化性。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

精密電子天平JJ200，紫外可見分光光度計TU-180。

鄰苯二酚，4- 甲基兒茶酚，咖啡酸，對叔丁基鄰苯二酚，ABTS，無水乙醇，冰乙酸，吡啶，過硫酸鉀（均為分析純）。

1.2 試樣制備

稱取一定質量的鄰苯二酚、4- 甲基兒茶酚、對叔丁基鄰苯二酚、咖啡酸，分別用無水乙醇溶解并定容至100mL，制成樣品母液，得到母液濃度為0.1mM。分別取 3 組 0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mL 0.1mM 的母液于5個10mL的容量瓶中作為樣品待測液。

1.3 ABTS+·清除能力測定

配制ABTS+·儲備液：配制4.0mM的ABTS及1.41mM的K2S2O8的蒸餾水溶液2.0mL，在室溫、避光條件下靜置16h。配制ABTS+·測定液：將ABTS+·儲備液用無水乙醇稀釋至100mL，使ABTS+·溶液終濃度約80μM。

測定：取2mL ABTS+·測定液及2mL 樣品待測液加入同一比色管中，震蕩搖勻30min后，測定其在734nm 波長處的吸光度（Absdetect），再測定2.0mL ABTS+·溶液與2.0mL無水乙醇的吸光度（Absref）作為空白組。每隔一段時間測定1次，至2次所測相差10%以內反應達到平衡，每組均為3次平行測量平均值。ABTS+·清除率按以下公式計算：

ABTS+·/% = （Absref-Absdetect）/Absref

以乙醇為溶劑溶解鄰苯二酚及其衍生物，測試捕獲ABTS+·的能力，然后在反應體系中引入醋酸和吡啶，分別使其濃度達到130mM，并測試捕獲ABTS+·的能力。

2 結果與分析

2.1 乙醇溶劑中鄰苯二酚及其衍生物與ABTS+·的反應

由圖1鄰苯二酚及其衍生物在乙醇中與ABTS+·作用達到平衡時捕獲ABTS+·時的IC50，列于表1。根據表1中的數據，可以發現在無水乙醇溶劑中，捕獲ABTS+·的相對抗氧化能力順序為：咖啡酸＞鄰苯二酚＞4- 甲基兒茶酚＞對叔丁基鄰苯二酚。這是和抗氧化劑的結構有關。鄰位酚羥基可以形成分子內氫鍵，有利于生產更穩定的酚氧自由基，抗氧化劑形成的自由基越穩定，其清除自由基的能力就越強。由于咖啡酸具有較大的共軛體系，其羥基與ABTS反應后形成的自由基可被大的共軛體系所穩定，此外，咖啡酸中的取代基的雙鍵增強了共軛效應，使酚羥基的氫離子更容易離去，因此捕獲自由基的能力最強。而甲基和叔丁基取代基在共軛基團中是吸電子基團，使酚羥基的氫離子不容易被脫去，叔丁基的吸電子效應還強于甲基，更不容易脫去氫離子。

圖1 鄰苯二酚及其衍生物 - 醇 -ABTS+·

2.2 酸性條件下鄰苯二酚及其衍生物與ABTS+·的反應

由圖2鄰苯二酚及其衍生物在冰醋酸中與ABTS+·作用達到平衡時捕獲ABTS+·時的IC50，列于表1。由圖2及表1中的數據，可以看到這4種抗氧化劑在冰醋酸 - 乙醇溶液中時相對抗氧化能力的IC50和在乙醇中變化不大。這說明酸的加入減弱了抗氧化性。這是因為冰醋酸和抗氧化劑本身都是氫原子給予體，一方面冰醋酸抑制了鄰苯二酚及其衍生物OH給出氫離子的能力，而另一方面冰醋酸作為氫原子給予體也電離出一部分氫離子，從而使鄰苯二酚及其衍生物的IC50值基本不變。

圖2 鄰苯二酚及其衍生物 - 酸 -ABTS+·

2.3 堿性條件下鄰苯二酚及其衍生物與ABTS+·的反應

由圖3鄰苯二酚及其衍生物在吡啶中與ABTS+·作用達到平衡時捕獲ABTS+·的IC50，列于表1。由圖3中的數據，可以發現在吡啶 - 乙醇溶液中，鄰苯二酚及其衍生物捕獲ABTS+·的IC50值比在乙醇溶液中減小很多，這說明吡啶的加入，增強了抗氧化劑的清除自由基的能力。這是由于在吡啶的堿性條件下，促進抗氧化劑更容易電離出氫離子，從而使鄰苯二酚及其衍生物的IC50值減小，清除自由基能力增強。

圖3 鄰苯二酚及其衍生物 - 堿 -ABTS+·

表1 在乙醇，醋酸- 乙醇，吡啶- 乙醇溶液中，鄰苯二酚及其衍生物捕獲ABTS+·的IC50值

3 結論

（1）鄰苯二酚及其衍生物對自由基ABTS+·清除能力與抗氧化劑的結構有關。鄰位酚羥基形成分子內氫鍵，有利于生產更穩定的酚氧自由基抗氧化劑。咖啡酸中的雙鍵增強了共軛效應，使OH的氫離子更容易離去。而甲基和叔丁基取代基在共軛基團中是吸電子基團，使OH的氫離子不容易被脫去。

（2）鄰苯二酚及其衍生物對自由基ABTS+·清除能力與溶劑的酸堿性有關。在酸性條件下，冰醋酸抑制了鄰苯二酚及其衍生物給出氫離子的能力，但作為氫給予體也電離出部分氫離子，清除能力變化不大；堿性條件下，促進鄰苯二酚及其衍生物更容易電離出氫離子，清除自由基能力增強。

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