微RNA調控少突膠質細胞分化及其在脫髓鞘疾病中的研究進展

陳婉燕，李家速△，毛方圓綜述，姚忠祥審校

（第三軍醫大學：1.學員旅；2.基礎部生理學教研室，重慶400038）

少突膠質前體細胞（OPC）分化為成熟少突膠質細胞（OL）是中樞神經系統（CNS）神經元軸突髓鞘形成的關鍵環節。諸多轉錄因子，如性別決定區Y基因相關高可變區基因10（SOX10）、ZFP191等促進因子和Hes5、SOX6、PDGFRα及ZFP238等抑制因子，在細胞分化過程中發揮著重要的調控作用[1]。近年來，漸成說機制（epigenetic mechanisms）在調控OL分化過程中同樣發揮重要作用，包括核小體組蛋白脫乙酰化酶共價修飾、染色質重塑、DNA甲基化及非編碼RNAs介導的基因沉默等[2]。微RNA（miRNA）是一類長度約22個核苷酸的內源性單鏈非編碼RNA，表達具有組織特異性，遺傳保守性。成熟miRNA 5′端的核心序列（約2～8 nt的種子序列）與靶m RNA的3′端非編碼區（UTR）堿基互補配對，引導RNA誘導的沉默復合體（RNA－induced silencing complex，RISC）對靶基因轉錄后抑制或降解，下調靶基因（約人類基因組30%）的表達[3]，發揮相應miRNA的生物學功能[4]。近年來，大量研究證實miRNA在細胞增殖分化、神經發生、腫瘤形成等諸多生物過程中發揮重要作用，尤其是miR－219、miR－338等OL系特異性miRNA的發現及其功能研究的開展[5－6]，miRNA已成為多發性硬化、腦白質營養不良癥等脫髓鞘疾病髓鞘再生領域的研究熱點。本文就miRNA調控OL分化及其在脫髓鞘疾病中的研究進展綜述如下。

1 特異性miRNA調控OL分化和髓鞘形成的機制

迄今為止，miRNA有數條通路可以促進OL分化和髓鞘形成，挽救和修復髓鞘形成缺陷，如抑制保持OPC未分化狀態的負性基因，增加OPC和OL的數量，抑制不恰當的非OL系但卻在OPCs或OLs中高水平表達的調控因子等[7]，從而為脫髓鞘疾病髓鞘再生提供新的思路。

1.1 抑制保持OPC未分化狀態的負性基因 將miRNA引入對OL分化作用的研究，利用miRNA成熟關鍵酶Dicer1敲除小鼠模型證實miRNA功能缺失會導致CNS髓鞘形成延遲及OL分化異常，OPC沒有進一步分化為成熟的形成髓鞘的OL而是廣泛增殖[5－6]，可見成熟miRNA對正常OL分化和CNS髓鞘形成的關鍵性作用。miRNA microarrays和qRTPCR分析等發現有數個miRNA在OL分化的動態過程中表達顯著變化[8]，其中miR－219和miR－338的表達在圍產期的急劇增長與此期OL成熟作用的開始相一致[6]。miRNA功能性研究和擬態（mimics）表明，miR－219可促進表達早期和晚期OL分化標記物，能部分挽救Dicer1缺失導致的OL分化缺陷引起的髓鞘形成障礙，過早產生大量MBP和形態多樣的成熟OLs；而miR－138只能促進表達早期OL分化標記物（CNP＋MBP＋MOG－），可能與其延伸OL分化的未成熟階段，使得更多的未成熟OLs纏繞到軸突周圍，拓寬終末分化的OLs選擇和準確地在軸突旁生成髓鞘的時間窗有關[5]。

為了弄清楚miRNA調控OL分化的具體機制，兩個小組在研究了相關miRNA表達模式后篩選TargetScan、miRanda及mirBase等數據庫，找尋算法預測的、在OPC高表達、在OL分化過程中被高度抑制的miRNA預測靶基因。雖然miR－219、miR－338缺乏同源序列，但此二者都被預測靶向負性調節OL分化的轉錄因子，如PDGFRα、SOX6、Hes5及ZFP238等候選靶標。研究利用攜有miR－219、miR－338及其相應反轉序列的質粒載體分別轉染HEK293、COS7細胞，而熒光蛋白報道分子下游區為SOX6和Hes5的3′UTR，抑制作用以預測結合位點的存在為前提。研究發現miR－219、miR－338的過表達都顯著降低了攜有Sox6和Hes5 3′UTR預測結合位點的熒光蛋白報道分子的活性。而種子序列及預測結合位點的突變都將影響這種抑制作用的產生，可見miRNA正是與這些位點結合，從而發揮對分化抑制因子的直接抑制作用，進而促進OL分化成熟。

1.2 增加OPC和OL數量 研究發現由同一前體轉錄本加工得到的miR－17－92家族，包括miR－17、－18a、－19a、－20a、－19b和－92a，尤其是miR－19b，在控制OL數量中起著重要作用[9]。研究通過使用Cre－loxP重組系統和2′，3′－環核苷酸3′磷酸二酯酶（Cnp）啟動子，敲除E18.5小鼠胚胎Dicer1（Cnp－Cre－Dicer），發現小鼠大腦中OL數量減少約40%，但不是在脊髓中，可見miRNA在脊髓和大腦發育過程中存在不同的作用機制。賀雪蓮等[10]也發現了OL相關miRNA差異性調控大腦和小腦OPCs的增殖。

基因存在論（gene ontology）提示腫瘤抑制基因PTEN，可能是miR－19b的預測靶標。miR－19b的過表達通過激活其下游PI3K／Akt／m TOR信號通路靶點的磷酸化來下調OPC中PTEN的蛋白水平，發揮基因放大效應，能夠促進細胞生長甚至腫瘤形成。miR－17－92家族的過表達能夠增加生成髓鞘的OL數量，可能在少突膠質細胞瘤中也起著重要作用。

1.3 調節OL相關或非OL系基因表達 除了OL系分化特異和必需的miRNA，其他調節OL系相關或非OL系基因對OL分化及髓鞘的形成和維持也是必要的。如miR－23可通過動態調節核纖層蛋白B1（lamin B1）的表達對OL的分化成熟和髓鞘形成、維持進行調控[11]。此外，在OPC上游區，可以抑制神經祖細胞分化為神經元和星形膠質細胞，通過細微改變相關基因的表達而不至于影響其正常生理功能，從而達到調控OL分化的效果。例如，miR－184可以靶向在星形膠質細胞中與GFAP共表達的基因BCL2－like 1（Bcl2l1），從而抑制易化星形膠質細胞分化的基因，增加能形成髓鞘的成熟OL數量[6]。miR－219和miR－338也靶向調節神經元分化的基因，如神經細胞分化因子NeuroD1，Isl1和Otx2[6]。這些轉錄因子對皮質發育中細胞分化和神經元存活起關鍵作用。總之，這些研究提供了miRNA是OL分化成熟及髓鞘生成及維持的重要轉錄后調控作用的證據，也為脫髓鞘疾病的藥物研發提供了新的靶點。

2 miRNA在脫髓鞘疾病發病機制中的作用

miRNA表達和功能的異常已被證實與多種疾病的發生發展有關。近來的一些研究表明miRNA在OL相關的髓鞘變性疾病，如多發性硬化、腦白質營養不良等，扮演了重要的角色，從而引發了對miRNA潛在的診斷價值和治療新藥研發的探索。

2.1 多發性硬化（multiple sclerosis，MS） MS是一種CNS慢性炎癥性脫髓鞘疾病。免疫反應介導的OL源性病理過程是MS發病的重要事件，而OL的招募和成熟缺陷是引起MS髓鞘形成障礙和軸突損傷的重要原因。雖然已證實miRNA在OL分化和髓鞘形成及維持中的重要作用，但miRNA究竟是如何將OL和MS聯系在一起的機制還不是很清楚。不過近年的研究已間接揭示了miRNA的異常調節可能參與了MS的炎性發病機制[12]。

研究發現，含較少表達IL－17的T輔助細胞（TH－17細胞）的小鼠不易感染實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）。而miR－326能夠通過抑制TH－17細胞里一種稱作Ets－1的功能靶標的翻譯來調節TH－17細胞的分化，而Ets－1是TH－17細胞分化的負性調節因子。MiR－326表達下降或增加分別延緩或加重了EAE的發生發展。在MS小鼠體內，miR－326的表達比對照組顯著上調，而這個結果和該疾病的嚴重程度及IL－17的表達量密切相關[13]。Otaegui等[14]發現MS患者外周血單核細胞中miR－18b和miR－599可能與MS復發有一定的關聯，而miR－96則可能與癥狀緩解有關。miRNA在其他細胞如形成髓鞘的OL中的功能研究將對理解相關疾病的發病機制起著重要作用，而其也可能會成為MS潛在的藥物研發靶點。

此外，通過分析MS患者活動期和緩解期病變腦白質中的不同miRNA的表達，Junker等[15]建立了MS miRNA庫，發現在疾病不同狀態miRNA的組織表達有一定差別，比如miR－155，－34a和－326在活動期MS病變組織中表達顯著增強，下調了其靶標調節性蛋白CD47的表達，解除了CD47對巨噬細胞和小神經膠質細胞的抑制作用，進而促進了其對髓鞘蛋白的吞噬作用。Keller等[16]通過對MS病理過程中miRNA表達譜的研究，認為利用miRNA能準確地將患病者與健康個體區分開。尤其是血清中的miR－145、miR－146a具有高度的準確性、特異性、敏感性[16－17]。這些數據表明，miRNA的表達譜將會成為診斷MS的非常有前景的生物標記，因此單個或多個miRNA表達異常的圖譜將在研究MS復雜的發病機制方面發揮舉足輕重的作用。未來的研究將會闡明這些小分子是否對不同亞型MS的發病機制同樣適用。

2.2 腦白質營養不良癥（Leukodystrophy） 迄今為止，成人染色體顯性腦白質營養不良癥（ADLD）是惟一與lamin B1突變有聯系的疾病。lamin B1的大量復制，mRNA和蛋白質水平的大量增加，可以導致ADLD患者大腦中嚴重的脫髓鞘表型[18]。Lin和Fu[11]發現lamin B1的過表達將影響核膜蛋白LAP2的亞細胞定位、染色質結構及核孔復合體轉運功能，并抑制OL系特異基因的表達。lamin B1的表達水平動態調節著OL成熟作用和髓鞘形成及維持。熒光蛋白報告分子和蛋白印記證實miR－23作為lamin B1的一種負性調節因子，能夠劑量依賴性地消除lamin B1大量復制帶來的OL成熟缺陷和髓鞘形成障礙。可見，miR－23是OL發育的正性調節因子而lamin B1是OL分化成熟作用和髓鞘形成的抑制因子。研究強調了體內miR－23精細調節lamin B1表達對控制OPC向成熟OL轉化和髓鞘形成的重要性，對其作用機制的進一步研究，可能為ADLD和其他髓鞘形成障礙疾病提供新的治療思路。

3 展 望

miRNA通過抑制維持OPC未分化狀態的OL分化負性調節因子，增加OL數量，并且抑制不恰當的非OL系或在OPC和OL高水平表達的調控基因，從而在OL分化成熟和髓鞘形成及維持中發揮重要的調控作用。miRNA潛在的臨床意義，在于對疾病發病機制、分型和疾病狀態具有診斷和預測價值，并為脫髓鞘疾病新藥的研發提供新的靶點。因此，對miRNA調控網絡及其在髓鞘形成障礙疾病中OL靶向定位髓鞘再生領域仍需深入研究。此外，取得成功治療的前提是miRNA安全高效的轉導，包括miRNA的修飾和病毒等載體的使用。近來有關靈長類動物LNA（locked－nucleic－acid）介導的miRNA沉默的研究認為LNA修飾的寡核苷酸類在體內miRNA功能的研究和未來基于miRNA的基因治療中有著較大潛能[19]。深入了解特殊疾病類型中miRNA差異表達譜，已預測靶點及其相互作用，將為相關疾病的診斷預測及治療提供新的指導。

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